Elementos De Espectroscopia

I.INTRODUCCION.

La espectrofotometría es un método analítico que utiliza los efectos de la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia (átomos y moléculas) para medir la absorción o la transmisión de luz por las sustancias.

En bioquímica, se utiliza fundamentalmente para:

a) Identificar compuestos por su espectro de absorción.

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida a diferentes valores de longitud de onda.

b) Conocer la concentración de un compuesto en una disolución.

c) Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.

II. CARACTERISTICAS GENERALES DE LA RADIACION.

Las sustancias químicas son capaces de absorber luz (o radiaciones electromagnéticas) de determinadas longitudes de onda; en concreto aquellas radiaciones cuya energía es igual a la diferencia de energía entre los estados fundamental y excitado de los átomos o moléculas que las componen.

III. TRASMITANCIA Y ABSORBANCIA.

Cuando un haz de luz monocromática (de una sola longitud de onda) incide sobre una disolución de una sustancia que la absorbe, la intensidad de la luz transmitida (la que atraviesa la disolución) es menor que la incidente.

Si I0 es la intensidad de la luz incidente e It es la intensidad de la luz transmitida, entonces la sustancia absorbe el 20% de la luz incidente y transmite el 80%. Así pues, se define la Transmitancia (T) como la fracción de la luz incidente que es transmitida.

T = It/I0

Y se define la Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O.) como el logaritmo en base 10 del inverso de la transmitancia.

A = log 1/T = -log T

La absorbancia de una sustancia en disolución depende del espesor de la muestra, de la concentración del compuesto absorbente y de la naturaleza química de éste.

Esto se expresa mediante la ley de Lambert-Beer:

A =  ● C ● l

ε (l•mol-1•cm-1) = coeficiente de extinción molar característico de cada sustancia y de cada longitud de onda.

c (mol • l-1) = concentración de la solución.

l (cm) = paso de luz (ancho de la cubeta donde se coloca la solución).

IV. ESPECTROFOTOMETRO.

La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolución se miden con un aparato denominado espectrofotómetro:

Fuente de luz: lámpara que emite una mezcla de longitudes de onda. Puede ser de tungsteno (luz visible e infrarroja) o de deuterio (luz ultravioleta).

Colimador: conjunto de lentes que enfocan la luz convirtiéndola en un haz de rayos paralelos.

Monocromador: dispositivo que selecciona luz de una única longitud de onda. Está compuesto por un difractor, que suele ser un prisma que descompone la luz policromática en sus diferentes longitudes de onda, y por un selector que sólo deja pasar la luz de la longitud de onda seleccionada.

Compartimiento de la muestra: lugar donde se coloca la solución a medir, en una cubeta o en un tubo de ensayo.

Detector fotoeléctrico: transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente eléctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.

Registrador: mide la señal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada.

V.METODO ESPECTROFOTOMETRICO Y ANALISIS.

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya

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