Espectrometría UV-Vis para la cuantificación colorimétrica de biomoléculas

Espectrometría UV-Vis para la cuantificación colorimétrica de biomoléculas

Mayra Rivera-Segura1*, Mónica Julieth Moreno-Vasquez2

1,2Universidad de la Amazonia. Florencia, Colombia

Autor para correspondencia*: mayr.rivera@udla.edu.co

Abstract

Resumen

Introducción

El estudio de una biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, para ser más específicos, la espectroscopía ultravioleta-visible, ya que con este método se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. (Nieves Abril Díaz, 2008)

La principal característica de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UVvisible, las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo cual es un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas. (González Ferrer, 2013)

Debido a que las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna, cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2, donde sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas, es decir que la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula, constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental. (Diaz, 2011)

La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε*c*l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, lo que quiere decir es que a mayor número de moléculas es mayor la interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución, es decir que a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo. Además la ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc. (Vidriales, 1991)

Metodología

Se realizó la practica por medio del simulador Espectrofotómetro UV-VIS virtual http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm, el cual se ejecutó  4 actividades distintas y se recolecto los datos.

Determinación de la concentración de glucosa por un método enzimático colorimétrico

Para este experimento se utilizó dos muestras donde se determinó la concentración de glucosa, se dispuso de la disolución patrón de glucosa, la disolución salina, el reactivo cromógeno (contiene glucosa oxidasa, peroxidasa, fenol, 4-aminofenazona,  tampón Tris 92 mM, pH=7.4).

Se inició el experimento, primero se conectó el espectrofotómetro y se ajustó la longitud de onda a 505 nm. Se empleó las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, se preparó en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla 1.

Cuando se completó cada tubo, se añadió 1 mL del reactivo cromógeno y se esperó hasta que se desarrolló la reacción. Se usó la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Se introdujo la cubeta al espectrofotómetro y se pulso el botón “A=0”. Se sacó la cubeta y se vacío. Se transfirió con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, se metió ésta al espectrofotómetro y se anotó el valor de absorbancia. Se repitió el procedimiento con los demás tubos.

Se construyó una tabla con la concentración de glucosa en la mezcla de cada tubo (tubos 0 a 5) y el respectivo valor de absorbancia. Para el análisis de resultados se realizó una gráfica representando las absorbancias obtenidas en cada tubo preparado con glucosa patrón (tubos 0 a 5) frente a la concentración de glucosa. Se ajustó los datos a una línea recta. Y a partir de estos se calculó las concentraciones.

Determinación de la glucemia (concentración de glucosa en sangre)

Para esta actividad se utilizó dos muestras de suero donde se determinó la concentración de glucosa, se usó la disolución control de glucosa (o patrón), con concentración de 100 mg/dl, disolución salina, reactivo cromógeno (contiene glucosa oxidasa, peroxidasa, fenol, 4-aminofenazona, tampón Tris 92 mM, pH=7.4)

Primero, se conecto el espectrofotómetro y se ajustó la longitud de onda a 505 nm. El control se analizó por triplicado (tubos 1, 2, 3). En los tubos 7 y 10 se añadió disoluciones ½ de suero y en los tubos 8 y 11 se diluyo 1/5. Se empleo las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, se preparó en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla 2.

Cuando se tuvo todos completos, se añadió 2 mL del reactivo cromógeno a cada uno de los tubos y se esperó hasta que se desarrolló la reacción, se usó la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Se introdujo la cubeta al espectrofotómetro y se pulso el botón “A=0”. Se sacó la cubeta y se vació. Se transfirió con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, se metió ésta al espectrofotómetro y se anotó el valor de absorbancia. Se repitió el procedimiento para el resto de tubos.

Se calculó la concentración de glucosa en los tubos control (1 a 3) y el promedio de sus absorbancias. Se empleó la ley de Lambert-Beer: A = ε × ℓ × c, mediante comparación de cada muestra problema con el control, se calculó las concentraciones.

Determinación de la concentración de proteínas por un método colorimétrico: método de Lowry

Para esta actividad se utilizó dos muestras en las que se determinó la concentración de proteínas, se empleó la disolución patrón de seroalbúmina bovina, reactivo C (A, B1 y B2 en proporciones 100: 1 : 1 (volumen)), reactivo A (Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M), reactivo B1 (CuSO4·5H2O al 1%), reactivo B2 (tartrato sódico-potásico al 2%), reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1/4 en agua.

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