INSTRUCTIVO ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

1. PRINCIPIO DE FUNCIONAMIENTO.

Es necesario recordar algunos términos a la hora de saber cómo funciona un espectroscopio. Pues bien, mencionadas definiciones son las siguientes:

• Energía radiante. Propagación de la energía a través del espacio sin el soporte de la materia.

• Transmitancia. Magnitud que relaciona la energía radiante que atraviesa una muestra y la energía que incide sobre ella. Es el paso de la radiación a través de un medio sin cambio en su frecuencia y se simboliza τ.

• Absorbancia. Magnitud que representa la cantidad de energía radiante que es absorbida por un cuerpo o sustancia y se simboliza α.

• Longitud de onda. Distancia entre las crestas de una onda periódica, se simboliza λ.

• Ancho de banda espectral (ABE).

Ahora bien, se conoce como espectrofotometría ultravioleta visible (UV-Vis) al método óptico de análisis que tiene como principio de medición la absorción y/o transmisión de la energía radiante emitida por una fuente de luz, que atraviesa una sustancia. El método es espectroscópico porque se basa en la medida de la intensidad y de la longitud de onda de la energía radiante. La región del espectro electromagnético aplicada es la ultravioleta visible que esta entre 10 nm y 780 nm., así como se muestra en la siguiente figura.

El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorción de radiación ultravioleta visible por una molécula, causando la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado, liberándose el exceso de energía en forma de calor. La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, éstos son promovidos a estados excitados (de energía mayor). Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia correcta, ocurre una transición desde uno de estos orbitales a un orbital vacío. Las diferencias entre energías varían entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan coloración en las moléculas ya que absorben energía en el visible así como en el UV.

Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io), o rango de luz que sale del tubo de fotocolorimetría y que va a llegar a la celda fotoeléctrica es atenuada hasta I que sería el rango de luz captado por el tubo de fotocolorimetría. Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia (τ) (τ = I/Io). Por aspectos prácticos, se utilizará la absorbancia (α) en lugar de la transmitancia (α = -log τ), por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente según la Ley de Beer-Lambert: α = •l•c ( : coeficiente de absorbitividad molar “característico de cada sustancia”, l: camino óptico o largo del paso de la cuba y c: concentración de la especie absorbente).

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia; éste muestra las longitudes de onda donde se registra absorción y cuantifica dicha absorción.

2. APLICACIONES Y USOS INDUSTRIALES.

El espectrofotómetro es utilizado en los laboratorios de química sobre todo para la cuantificación de sustancias y microrganismos; permite al operador realizar dos funciones como son dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra, así como también poder indicar indirectamente la cantidad de una sustancia que interesa y esté presente en la muestra.

El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para una concentración particular se conoce como factor de respuesta.

3. PARTES Y FUNCIONES.

Existen dos tipos de espectrofotómetros, siendo de simple o doble haz. En un instrumento de un solo haz, toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia.

Ahora bien, los componentes de un espectrofotómetro son:

Cubetas de espectrofotometría:

En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz ultravioleta; en segundo plano, de plástico, para colorimetría (es decir, empleando luz visible).

Fuente de luz:

La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámparas de wolframio (también llamado tungsteno), lámpara de arco de xenón y lámpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atómicos.

Monocromador:

Aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromática. Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.

Compartimiento de Muestra:

Es donde tiene lugar la interacción, con la materia (debe producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes

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