Expresión en Escherichia coli de un gen sintetizado químicamente para la hormona de la somastatina

Expresión en Escherichia coli de un gen sintetizado químicamente para la hormona de la somastatina

Abstract: Un gen de la somastatina, una hormona peptídica de mamífero (14 residuos de aminoácidos) se sintetizó por métodos químicos. Este gen se fusionó al gen de β- galactosidasa en Escherichia coli en el plásmido pBR322. La transformación de E. coli con el ADN plasmidico quimérico condujo a la síntesis de un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos correspondientes a somatostatina. In vitro, la somatostatina activa fue separada específicamente de la proteína larga quimérica por tratamiento con bromuro de cianógeno. Esto representa la primera síntesis de un producto polipéptido funcional de un gen de origen de síntesis química.

Artículo: La síntesis química de DNA y métodos de recombinación de DNA brinda la tecnología para el diseño y la síntesis de genes que se pueden fusionar a elementos plasmídicos para su expresión en E. coli u en otras bacterias. Como un sistema modelo, hemos diseñado y sintetizado un gen para la pequeña hormona polipeptidica, la somatostatina (Fig. 1 y 2). Las principales consideraciones en la elección de esta hormona son su pequeño tamaño y  su secuencia de aminoácidos conocida, su sensibilidad a radioinmuno ensayos y  ensayos biológicos, y su característico interés biológico. La somatostatina es un tetradecapéptido, fue originalmente descubierto en extractos  hipotalámicos de ovinos, pero posteriormente también se encontró en cantidades  significativas en otras especies y otros tejidos. La somatostatina inhibe la secreción de una serie de hormonas, incluyendo la hormona del crecimiento, insulina y glucagón. El efecto de la somatostatina sobre la secreción de estas hormonas ha atraído la atención sobre su valor terapéutico potencial en acromegalia, pancreatitis aguda, y dependientes de insulina.

La construcción del gen de la somatostatina y el plásmido fue diseñado para dar lugar a la síntesis in vivo de un precursor de la somatostatina (ver Fig. 1).La proteína precursora no se esperaría que tenga actividad biológica, pero podría ser convertida a una forma funcional por escisión con bromuro de cianógeno después de la extracción celular. El gen sintético de la somatostatina se fusionó al operón lac porque los sitios de control de este operón están bien caracterizados.

Dada la secuencia de aminoácidos de la somatostatina, se pueden diseñar a partir del código genético un fragmento corto de DNA que contiene la información para sus 14 aminoácidos (Fig. 2). La degeneración del código permite un gran número de secuencias posibles que podrían codificar para los mismos 14 aminoácidos. Por lo tanto, la elección de codones era algo arbitraria excepto por las siguientes restricciones: Primero, los codones de aminoácidos que se ven favorecidos en E. coli para la expresión del genoma MS2 se utilizaron cuando fuera adecuado. Segundo, ya que la secuencia completa se construye a partir de una serie de fragmentos solapantes, los fragmentos se diseñaron para eliminar el apareamiento indeseable inter e intramoleculares. Y tercero, secuencias ricas en GC (guanina-citosina) seguido por AT (adenina-timina) fueron evitadas ya que podrían terminar la transcripción.

Ocho oligonucleótidos, que varían en longitud de 11 a 16 nucleótidos, marcado en la figura 2 como de A a H, se sintetizaron por el método del triéster. Además de los 14 codones para la información estructural de la somatostatina, otras características construyeron la secuencia de nucleótidos: En primer lugar, para facilitar la inserción del DNA al plásmido, se crearon extremos 5’ de cadena sencilla con la secuencia de reconocimiento para las endonucleasas de restricción EcoRi y BamHI. En segundo lugar, un codón de metionina precede al aminoácido NH2-terminal normal de somatostatina, y el codón COOH-terminal es seguido por dos codones sin sentido.

En la clonación y expresión del gen sintético de la somatostatina se utilizaron dos plásmidos. Cada plásmido tiene un sitio para Eco RI en regiones diferentes del gen estructural de la β-galactosidasa (ver Fig. 3 y 4). La inserción del fragmento de DNA sintético de la somatostatina en los sitios Eco RI de los plásmidos somete la  expresión de la información genética del fragmento a control del operón lac. Después de la inserción del fragmento de somatostatina en estos plásmidos, la traducción debe resultar en una somatostatina precedida por diez aminoácidos (pSOM1) o por prácticamente toda la estructura de la β-galactosidasa (pSOM11-3)

El esquema de la construcción del plásmido (Fig., 3) comienza con el plásmido pBR322, un vehículo de clonación bien caracterizado. Los elementos lac se introdujeron a este plásmido por inserción de un fragmento de restricción Hae III (203 nucleótidos) que lleva el promotor lac, el sitio de unión de la proteína activadora del gen, el operador, el  sitio de unión proteína-ribosoma  y los primeros siete codones de aminoácidos del gen estructural de la β-galactosidasa (Fig. 3 y 4). El fragmento Hae III se obtuvo a partir del DNA de λplac5.

El plásmido pBR322 cortado Eco RI, que tenía sus extremos terminales  reparados con DNA polimerasa T4 y desoxirribonucleótidos trifosfatos, presento extremos romos que se ligaron La unió de los extremos Hae III reparados de Eco RI generan el sitio  EcoRi en cada extremo (Figs. 3 y 4).

Las transformantes de E. coli RR1 con este ADN se seleccionaron por resistencia a la tetraciclina (Tc) y ampicilina (Am) en un medio con 5-bromo-4-cloro-indolgalactosido (X-gal). En este medio indicador, las colonias constitutivas para la síntesis de β-galactosidasa en virtud del aumento del número de operadores lac que titulan al represor, son identificadas por su color azul. Dos orientaciones del fragmento Hae III son posibles, pero estas se distinguen por la ubicación asimétrica de un sitio de restricción Hha en el fragmento. El plásmido PBH10 se modificó adicionalmente para eliminar el sitio EcoRi distal al operador lac (pBH20).

Los ocho oligodesoxirribonucleótidos químicamente sintetizados (Fig. 2) se marcaron en el extremo 5’ con [y-32P] ATP (adenina trifosfato) con la polinucleótido cinasa T4 y se unieron con DNA ligasa de T4. A través de enlaces de hidrógeno entre los fragmentos solapantes, el gen de la somatostatina se auto-ensambla y, finalmente, se polimeriza en moléculas más grandes a causa de los extremos cohesivos (sitio de restricción adicionado al gen). Los productos ligados se trataron con endonucleasas de restricción Eco RI y Bam HI para generar el gen de somatostatina (Fig.2). El fragmento del gen de la  somatostatina con extremos Eco RI y Bam HI se ligó al plásmido pBH20, tratado previamente con las endonucleasas Eco RI y Bam HI y con fosfatasa alcalina. El tratamiento con fosfatasa alcalina proporciona una selección molecular para los plásmidos que llevan el fragmento insertado. Transformantes resistentes a la ampicilina obtenidos con este ADN ligado se seleccionaron para sensibilidad a la tetraciclina, y varios fueron examinados para la inserción de un fragmento Eco RI-Bam HI del tamaño apropiado. Ambas cadenas de los fragmentos del plásmido Eco RI-Bam HI  de dos clones se analizaron mediante un análisis de la secuencia de nucleótidos a partir del sitio Bam HI y un sitio Eco RI. El análisis de la secuencia se extendió a los elementos de control lac; la secuencia del fragmento lac estaba intacta, y en un caso, pSOMI, la secuencia de nucleótidos de ambas cadenas se determino de forma independiente, cada uno dando la secuencia que se muestra en la Fig 3. En el otro caso, la secuencia era idéntica excepto para una deleción de pares de bases (A * T) en una posición equivalente a la unión de los oligonucleótidos B-C en el fragmento de DNA original. La base para la deleción no está clara.

...