PRÁCTICA N° 3 “Transferencia de material genético por conjugación en Escherichia coli”

[pic 1][pic 2]INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

PRÁCTICA N° 3

“Transferencia de material genético por conjugación en Escherichia coli”

FECHA  DE ENTREGA: 02 DE  JUNIO DE 2015

• OBJETIVOS

• Cuantificar la transferencia de material genético por medio de conjugación en bacterias Gram (-)
• Establecer las diferencias entre las transconjugantes que se obtienen a partir de células donadoras Hfr y F´y con receptoras Rec+ y Rec-

• INTRODUCCIÓN

Las bacterias no sólo pueden pasar sus genes a su descendencia, sino también lateralmente, es decir a otros microorganismos de la misma generación. Esto se conoce como transferencia genética horizontal y se puede producir de varias maneras, una de ellas, la conjugación.

La conjugación (descubierta en 1946 por Joshua Lederberg y Edwars Tatum) es un proceso de trasferencia de información genética de una célula donadora a una célula receptora en el cual existe contacto entre las superficies de las células. Favorece la variabilidad genética y la evolución; además explica el aumento de bacterias con resistencia a agentes microbianos.

• Descripción del plásmido F y sus funciones básicas.

El factor responsable de la fertilidad de E. coli, o sea, el plásmido F, es un ejemplo de plásmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano para integrarse en él (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de tres posibles estados:

• Autónomo, en las células F+.
• Integrado (como episoma), en las células Hfr.
• Autónomo, pero con un trozo de cromosoma bacteriano, en las cepas F'.

En cualquiera de estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.

• Estructura física del plásmido F:

• ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente.
• Superenrollado negativamente (requiere la acción de la girasa).
• Tamaño: 100 kilobases. El mapa físico de F posee coordenadas en kb de 0 a 100 (obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto), tomando como punto arbitrario de referencia (0/100) el borde izquierdo de la secuencia de inserción IS3a.

• Organización genética y funcional

Se han identificado unos 60 genes en el plásmido F que se dividen en:

Porción tra: (genes que codifican funciones relacionadas con la transferencia conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb (o sea, casi la tercera parte de F está dedicado a genes de conjugación). La mayor parte de esos genes están formando parte del operón Y que contiene aproximadamente unos 20 genes. Los genes tra se pueden clasificar en:

A. Necesarios para la biosíntesis y ensamblaje de los pili. Entre ellos está el gen traA, que codifica la pre-propilina, es decir, el precursor que por maduración se convertirá en la pilina F, la proteína constitutiva de los pili sexuales de tipo F. Otros genes tra intervienen en la maduración de la pilina, y en el ensamblaje de las subunidades del pili.

B. Estabilización de los agregados de conjugación: traG, traN.

C. Metabolismo del ADN durante la conjugación: traI, traD, traM, traY, traZ.

D. Regulación genética de la transferencia: traJ determina un activador transcripcional del gran operón tr; finP, finO formarían un sistema de control negativo sobre el gran operón traY, pero este sistema no es funcional en el plásmido F debido a que el finO tiene una inactivación insercional permanente por la secuencia de inserción IS3.

E. Exclusión de superficie: traS, traT.

Las células receptoras son denominadas F-, estas pueden clasificarse en Rec+ o Rec- dependiendo de si poseen el gen rec A. Por otro lado, las células donadoras presentan un plásmido (material extracromosómico generalmente de doble cadena, circular y covalentemente cerrado) sexual F. Según el estado en que se encuentre el plásmido, la célula donadora puede ser de tres diferentes tipos: F+, Hfr  y F´. Sin embargo, en estos tres estados, realiza el mismo tipo de funciones esenciales: posee una porción de genes tra que son los que codifican para funciones relacionadas con la transferencia conjugativa, secuencias de inserción (que permiten la integración de F en varios lugares del cromosoma, por medio de recombinación homóloga)  y dos secuencias ori  (es decir, orígenes de replicación). Una de ellas, la oriV actúa como origen de replicación vegetativa, y la otra, oriT, es el origen para la transferencia conjugativa. [Ver figura 1].

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Figura 1. Estructura general del plásmido F

En las células F+ el plásmido se encuentra libre en el citoplasma de la bacteria. La cruza de una célula donadora F+ con una célula receptora F- produce siempre una célula F+, esto se debe a que el plásmido es un elemento móvil, por lo tanto pasa a todas las células receptoras.    

Las células Hfr (High-frecuency recombination) surgen por la recombinación integrativa entre secuencias homólogas presentes simultáneamente en el plásmido F (episoma) y en el cromosoma conocidas como secuencias de inserción. Esta recombinación se da principalmente debido a la actuación del sistema de recombinación homóloga (dependiente de recA). Cada recombinación origina una Hfr distinta, dependiendo de las secuencias IS implicadas, de su localización dentro del cromosoma y de la orientación. Se dice que es una cepa Hfr H si la transferencia del material genético se produce en el mismo sentido que las manecillas del reloj y Hfr C si es en sentido contrario.

En la cruza de la célula donadora Hfr con una célula receptora F- el resultado será una célula F- , debido a que solo se transfiere una parte de todo el cromosoma bacteriano pues el puente citoplasmático casi siempre se corta antes de los 100 minutos que se requieren para completar el proceso de movilización y lo último que se transfiere es la porción del plásmido F que queda al otro lado de oriT, es decir, la región tra.

Las células F´ poseen al plásmido autónomo pero modificado por marcadores cromosómicos, estas surgen de la escisión del factor F en células Hfr. En la cruza de una célula donadora F´ con una célula receptora F- el resultado puede ser F´ o F´´.

Se dice que es F´´ cuando la célula receptora posee uno o más de los marcadores del plásmido F´, es decir, surge un diploide parcial o merocigoto (tiene dos formas alterativas para un mismo gen). Mientras que la transconjugante será F´ si la célula receptora no posee ninguno de los marcadores cromosomales presentes en el plásmido.

PROCESO DE CONJUGACIÓN

El primer paso de la conjugación es la formación de los agregados de apareamiento y la formación de pares específicos; es decir, una célula que contenga el plásmido F contacta por medio del pili (codificado por los genes traA y traQ) a la proteína OmpA de la célula F- .[Ver figura 2]

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Figura 2. Formación de agregado de apareamiento.

El pili se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia de que se va retrayendo. Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared y se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas células. [Ver figura 3]

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Figura 3. Puente conjugativo.

La expresión de genes de traS y traT ayudan a la exclusión de superficie, es decir, evita que se acerquen células donadoras a células donadoras.

Posteriormente se da la formación de pares efectivos, por medio de la intervención de los genes traN y traG, los cuales ayudan a la estabilización de los agregados de conjugación. Por último se lleva a cabo la movilización y transferencia del material genético, donde el gen traM señala el punto de corte en una cadena del plásmido (un poco atrás de OriT), el gen traI codifica para la helicasa que rompe los puentes de hidrógeno de la cadena de DNA, el gen traY corta los enlaces fosfodiester y el gen traD canaliza el DNA del plásmido de la célula donadora a la célula receptora. [Ver figura 4]. Una vez que se llevó a cabo la transferencia del material genético, el plásmido se replica o se recombina.

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Figura 4. Movilización del material genético.

La conjugación ha sido útil para el mapeo de los cromosomas de distintos microorganismos; este se hace con la secuencia con la que los marcadores son transferidos por las cepas Hfr. En la práctica presente se trabajan con cepas de Escherichia coli, por ello es importante conocer la posición de los marcadores genéticos. [Ver figura 5].

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Figura 5. Mapa genético parcial de Escherichia coli

Las células obtenidas de las cruzas, van a poseer distintas características a las de las  donadoras y receptoras. Dependiendo sus atributos, se pueden elegir medios de selección para evidenciar su presencia

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