Glucólisis

QUIMICA BIOLOGICA II

TRABAJO PRACTICO Nº 1

GLUCOLISIS

INTRODUCCIÓN:

La glucólisis es la ruta central, casi universal del catabolismo de la glucosa. Es parte de la degradación anaeróbica (fermentación) y se ha conservado completamente en los organismos aeróbicos.

Las levaduras Sacharomyces cervisiae poseen como mecanismo para obtener energía (en forma de ATP) las enzimas necesarias para realizar la fermentación alcohólica. En este trabajo práctico estudiaremos este metabolismo incubando a los microorganismos con glucosa y distintos inhibidores de las enzimas de la fermentación alcohólica que actúan a distintos niveles. Analizaremos sus efectos sobre esta vía metabólica mediante la medida del consumo de la glucosa.

Los inhibidores que se utilizarán son:

1. Arseniato: es un anión química y estructuralmente semejante al fosfato, muchas enzimas que utilizan fosfato pueden por error tomar al arseniato como parte de su reacción específica. Los compuestos orgánicos de arsénico son menos estables que sus análogos de fósforo. Por ejemplo, los acil-arseniatos se descomponen rápidamente por hidrólisis en ausencia de catalizadores:

Los fosfatos de acilo, tales como el 1,3-bisfosfoglicerato, son más estables y se transforman en las células por acción de las enzimas.

De esta manera, el arseniato actúa compitiendo con el fosfato, en la reacción catalizada por la gliceraldehído 3 - fosfato deshidrogenasa. Al no formarse el 1,3-bisfosfoglicerato, no se formará el fosfoenolpiruvato, y por lo tanto no se obtendrá ATP. (Normalmente, en la primera etapa de la glucólisis se consumen 2 ATP, y en la segunda etapa se forman 4 ATP, 2 en la reacción catalizada por la gliceraldehído 3 - fosfato deshidrogenasa, y 2 más en la reacción catalizada por la piruvato quinasa, al inhibirse una de estas dos enzimas, la producción de ATP es nula)

2. Fluoruro: Inhibe fuertemente a la enzima enolasa.

3. EDTA: Es un quelante de iones metálicos dipositivos, entre los cuales se encuentra el Mg2+. Por lo tanto inhibe las enzimas dependientes de Mg2+.

4. Ausencia de fosfato: Se estudiará como varía el consumo de glucosa en presencia y ausencia de fosfato, en general, cuando se agota el suministro de fosfato cesa la fermentación antes de que se utilice toda la glucosa.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos:

Glucosa 100 mM

Fosfato de Sodio 100 mM

Arseniato de Sodio 100 mM

Fluoruro de Sodio 500 mM

EDTA: 500 mM

Buffer MES – Na 10 mM pH 5,5

Levaduras: Sacharomyces cervisiae (cubito de levadura comercial)

Solución fisiológica (Cloruro de sodio 9 g/L)

Reactivos para determinación de glucosa

Metodología:

Se prepararon los siguientes tubos:

Tubo Glucosa Fosfato Arseniato NaF EDTA MES Células

0 0,1 mL ----- ----- ----- ----- 1,7 mL 1,5 mL

1 0,1 mL 0,2 mL ----- ----- ----- 1,7 mL 1,5 mL

2 0,1 mL ------ 0,3 mL ----- ----- 1,6 mL 1,5 mL

3 0,1 mL 0,3 mL 0,3 mL ----- ----- 1,3 mL 1,5 mL

4 0,1 mL 0,2 mL ----- 0,3 mL ----- 1,5 mL 1,5 mL

5 0,1 mL ----- ----- ----- ----- 1,9 mL 1,5 mL

6 0,1 mL 0,2 mL ----- ----- 0,3 mL 1,4 mL 1,5 mL

7 0,1 mL 0,1 mL ----- ----- ----- 1,7 mL 1,5 mL

Determinación de glucosa:

Se realizará por el método enzimático de acuerdo al siguiente esquema de reacciones:

(glucosa oxidasa)

1) GLUCOSA + O2 + H2O ----------> ÁCIDO GLUCÓNICO + H2O2

(peroxidasa)

2) H2O2 + 4 AF + FENOL ----------> QUINONA COLOREADA + H2O

La QUINONA COLOREADA tiene un máximo de absorción a 505 nm, esta es la longitud de onda a la cual leímos la absorbancia de los tubos.

Los datos obtenidos fueron:

Tabla de Absorbancias

TUBO ABS

0 0,427

1 0,445

2 0,440

3 0,471

4 0,449

5 0,506

6 0,375

7 0,453

Tabla comparativa de Glucosa remanente y Glucosa Consumida en cada condición de ensayo:

TUBO ABS % Glucosa remanente Consumo de glucosa

0 0,427 100,00 0,00

1 0,445 104,22 -4,22

2 0,440 103,04 -3,04

3 0,471 110,30 -10,30

4 0,449 105,15 -5,15

5 0,506 118,50 -18,50

6 0,375 87,82 12,18

7 0,453 106,09 -6,09

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