IBMC Actividad Alfa Amilasa

TRABAJO PRÁCTICO 4

Transformación de E. coli con ADN plasmídico

Introducción:

La transformación bacteriana es uno de los mecanismos de intercambio de material genético entre individuos de igual o distinta especie, que consiste en la adquisición de DNA desnudo proveniente del medio extracelular (generalmente de otras bacterias muertas). Si el DNA es un plásmido (como fue el caso realizado en ésta experiencia), puede quedar como elemento replicativo autónomo dentro de la célula. Para esto necesita un origen de replicación (ORI) y un gen de selección que en nuestro caso brinda resistencia a la ampicilina. Las bacterias susceptibles a ser transformadas se denominan competentes, y la técnica para generarlas son esencialmente empíricas. Una forma de determinar si son competentes es por medio del cálculo de la eficiencia. La eficiencia de una preparación de bacterias competentes se expresa como el número de unidades formadoras de colonias o UFC por microgramo de plásmido transformado (UFC/µg).

Objetivos:

• Transformación de bacterias Escherichia coli con el plásmido p-Bluescript purificado.

• Cálculo de la eficiencia de transformación de nuestro cultivo de bacterias en función del plásmido usado.

• Estimación de la concentración del plásmido p-Bluescript purificado en el TP anterior.

Metodología:

Cada grupo recibió 3 tubos eppendorf conteniendo 50 µl (c/u) de bacterias competentes en hielo. Las bacterias fueron previamente crecidas en un medio de cultivo para luego ser resuspendidas en una solución fría que contenía CaCl2. El catión Ca2+ neutraliza las cargas negativas de los grupos fosfatos del DNA provocando además que ésta molécula se adsorba sobre las membranas de las bacterias. Éste catión además altera la pared celular facilitando la entrada del DNA plasmídico.

Los tubos se mantuvieron en hielo para que las bacterias resuspendidas entraran en un periodo de letargo y asi poder causarles un tratamiento de shock térmico luego. Este tratamiento consiste en un cambio considerable de temperatura para generar un cambio brusco en la fluidez de las membranas de la bacteria.

Las siguientes etapas se realizaron en condiciones de esterilidad. Con un mechero encendido creamos un cono de esterilidad para manipular los tubos con sus reactivos y se esterilizaron la mesada y nuestras manos con alcohol etílico al 70 %. El material usado para plaquear las bacterias fue esterilizado con el alcohol mencionado y fuego entre cada plaqueado.

Antes de agregar el H2O estéril, el plásmido control, y el plásmido obtenido en el TP en los respectivos tubos, estos fueron sometidos a una centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, descartando 900 µl del sobrenadante y cultivando los 100 µl del pellet. Esto fue efectuado ya que en el TP anterior (electroforesis en gel de agarosa) el resultado había sido nulo, por lo cual hay posibilidad de que la extracción del plásmido haya sido ineficiente anteriormente o muy pequeña.

Al tubo Nº1 se le agregaron 100 µl de H2O estéril.

En el tubo Nº2 agregamos 100 µl de plásmido control. Este plásmido fue purificado por los docentes siguiendo la misma metodología utilizada en el TP anterior.

Al tubo Nº3 agregamos los 100 µl del plasmido extraído en el TP, correspondientes al pellet, luego de la centrifugación.

Sin embargo, también agregamos a un tubo N° 4, 100 µl del plásmido extraído por el grupo N°3, previamente tratado. Esto consistió en una dilución seriada: primero una dilución 1:10, 2 µl del plásmido en 18 µl de H2O; y luego una dilución 1:5, 2 µl de plásmido en 8 µl de H2O.

Se dejaron incubando en hielo durante 20 minutos.

Luego del periodo de incubación se aplico de inmediato el shock térmico a 42ºC por 90 segundos estrictos. Este método permite que actúe la combinación del Ca2+ y temperatura dando como resultado la formación de poros en la membrana plasmática, por los cuales entro el DNA plasmídico.

Inmediatamente pasados los 90 segundos se coloco en hielo con agua durante 5 minutos.

Pasados los 5 minutos se agregaron 950 µl de LB liquido a cada uno de los tubos, se homogeneizo por inversión y se dejo incubando 30 minutos a 37ºC en baño termostático.

En placas de LB solido con ampicilina (100 µl/ml) se agrego la suspensión

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