Inducción enzimática

Trabajo Práctico 6

Inducción enzimática

Grupo 7: Herrera Tomás, Otero Adrián .

INTRODUCCIÓN

Es muy común la utilización del operón lac para el estudio de la regulación génica y como ejemplo de ésta en procariotas. Los operones son unidades génicas funcionales formadas por un complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión y que codifican para la síntesis de proteínas que participan en vías metabólicas. El operón Lac es requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa en algunas bacterias como la Escherichia coli, y su expresión está regulada por tres factores de expresión:

Promotor: region de reconocimiento para la RNA Polimerasa, con el fin de llevar a cabo la transcripción.        

Operador: Se localiza luego del promotor y es reconocido por la proteína represora Lac I

Gen represor: Codifica para la proteína represora Lac I, que se une al operador impidiendo la transcripción. En presencia de Lactosa o algunos análogos estructurales de esta (como el IPTG), se separa del operador.

Además de los tres factores de transcripción, el Operón Lac presenta tres genes estructurales:

Gen Lac z: Codifica la enzima β-galactosidasa que cataliza la ruptura de la unión  β-1,4 entre la galactosa y la glucosa degradando la lactosa.

Gen Lac y: Codifica para la proteína galactósido permeasa que favorece la entrada de lactosa a la bacteria uniéndose a la membrana plasmática y formando carriers.

Gen Lac a: Codifica para la enzima tiogalactósido transferasa. Esta no está relacionada con el metabolismo de la lactosa.

Existe un control positivo ejercido por una proteína activadora llamada CRP que favorece la transcripción de los genes estructurales uniéndose al DNA y a un ligando (AMPc). Este ligando se une al promotor haciéndolo más afín a la RNA pol. En presencia de glucosa la expresión del mRNA es muy baja debido a que esta disminuye los niveles de  AMPc ejerciendo una represión por catabolito.

Para el análisis de la inducción enzimática, es importante tener controles tanto a nivel transcripcional, como traduccional, por esto durante el protocolo es necesario utilizar sustancias inhibitorias (Cloranfenicol) de traducción, para poder así constatar si la actividad enzimática depende de la inducción o de la activación de la enzima.

OBJETIVOS

Analizar la regulación de la expresión génica mediante la inducción del Operón Lac.

MATERIALES Y MÉTODOS

A 8 tubos eppendorf se les colocó lo siguiente:

  [Tabla 1] : Agregados de cada eppendorf

Se procedió a taparlos y mezclarlos por inversión. Luego se colocaron en un baño a 37°C (para fomentar el crecimiento de bacterias) y se agitó periódicamente. Transcurrido ese tiempo se agregó 600μl de buffer z (Na2HPO4  0,6M; NaHPO4 0.04M; KCL 0.01M; MgSO4 0.001M; β-Mercaptoetanol 0,05M) pH 7, 1 gota de SDS 0.1%  y 4 gotas de Cl3CH. Estos dos últimos se agregaron a todos menos al tubo 4. Se agitaron los tubos y se agregó 100μl de lactosa al tubo 8.

Para comprobar la inducción o no inducción del operón Lac en cada caso se midió la actividad de β-galactosidasa de la siguiente manera:

 Se trasvasó el contenido  de cada eppendorf en tubos de ensayo (uno por cada eppendorf)  y se los colocó en un baño termostatizado a 28°C (Temperatura ideal para la β-galactosidasa). Mientras se encontraban en el baño se les agregó 250μl de ONPG (orto-nitrofenilgalactosa) que es hidrolizado por la β-galactosidasa formando como uno de sus productos, orto-nitrofenol de coloración amarillo. De esta manera la solución de los tubos que tengan β-galactosidasa van a adoptar una coloración amarillenta. Se aguardo 15 minutos aproximadamente dejando los tubos en el baño y se retiraron agregando 500μl de Na2CO3 5% que frena reacciones y alcaliniza el medio haciéndolo más amarillo (en los casos en los que haya orto-nitrofenol).

RESULTADOS

  [Tabla 2] : Resultados

[pic 2][pic 3]

[Imagen 1]:Gradilla con tubos ordenados según escala de coloración.                        [Gráfico 1] : Histograma de intensidad de color.

CONCLUSIONES

Se pudo evidenciar, la modulación de la actividad enzimática, modificando los componentes del medio donde se encuentran las bacterias.Tanto con el agregado de sustrato como con la modificación de agentes permeabilizantes y/o moléculas con analogía estructural a las moléculas regulatorias de los procesos de transcripción o traducción.

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