Ingenieria Genetica

Preparación de un extracto celular vegetal, y purificación de Ácidos Nucleicos

Laboratorio #1 de Ingeniería Genética

22/09/2011

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Resumen

Se extrajo el contenido de Ácidos Nucleicos de una muestra vegetal (tejido foliar) de la planta de plátano. Para la obtención del material celular se utilizó un método físico que consistió en macerar la muestra en mortero con nitrógeno líquido. Se evalúan los resultados del protocolo empleado para la extracción del ADN y se realiza una discusión de los mismos.

Palabras Clave: Extracto celular, CTAB, precipitado, cloroformo, isopropanol, centrifugación, sedimentación, contaminantes.

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1. Objetivos

- Obtener una concentración de ADN-ARN visible mediante el empleo de una técnica de purificación especifica identificando en cada paso la función de los agentes químicos empleados y resaltando la importancia de cada uno de ellos.

- Procurar dilucidar un protocolo de extracción de Ácidos Nucleicos óptimo para células vegetales, teniendo en cuenta sus características estructurales y químicas.

- Reconocer y resaltar la importancia de los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos como base para el éxito (medido en términos de eficiencia y pureza) de las técnicas moleculares.

- Adiestrase en el uso de los instrumentos y materiales del laboratorio cuyo empleo es común en los procedimientos de extracción de ácidos nucleicos.

2. Descripción de la técnica

a) Lisis y obtención del extracto celular: Para la obtención del extracto celular se macero la muestra de tejido vegetal con mortero y pistilo, previa añadidura de nitrógeno líquido. El macerado se realizó hasta que la muestra estuvo bien molida (polvo). El extracto celular que se obtiene contiene en adición a los ácidos nucleicos, contaminantes consistentes en cantidades significativas de otras macromoléculas como proteínas y carbohidratos, y fragmentos de la pared celular.

b) Tratamiento con detergente: Se añadieron 800 μl de detergente CTAB con una alta concentración de sal (NaCl) a 500 mg del molido obtenido en un tubo eppendorf y se incubo durante 10 minutos a 65 ºC en baño maría. Cuando el CTAB es añadido al extracto celular vegetal los carbohidratos presentes en el extracto se precipitan.

c) Tratamiento con cloroformo: 1 ml del solvente orgánico fue añadido a la solución. El cloroformo precipita las proteínas pero deja los ácidos nucleicos en solución acuosa. Posteriormente se centrifugo a 14000 rpm durante 5 minutos.

d) Concentración de los Ácidos Nucleicos: Para concentrar los ácidos nucleicos se utilizo la precipitación con isopropanol. Al mezclar el isopropanol con la solución de ácidos nucleicos diluida, el precipitado que se forma puede ser recolectado por centrifugación y después redisuelto en un volumen apropiado de agua.

3. Resultados y Discusión

a) Lisis y obtención del extracto celular: Fue necesaria la adición de varias “dosis” de nitrógeno líquido durante el macerado, debido a que ocurría su evaporación al poco tiempo. El proceso de maceración tardo aproximadamente 15 minutos, tiempo tras el cual se obtuvo un polvo lo suficientemente fino.

b-c) Tratamiento con detergente y cloroformo: Tras la centrifugación posterior a la adición del detergente CTAB y del isopropanol, en el tubo eppendorf pudo observarse lo siguiente:

- Capa acuosa o sobrenadante conteniendo

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