La extracción de ADN

1º.- La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen.

2º.- La sal evita la unión de las proteínas al ADN.

3º.- Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Introducción

En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtención de esta molécula a partir de material biológico. La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos críticos que componen el aná-lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extracción de ADN es quizás el más desconocido y sobre el que más control podemos ejercer. La extracción del ADN de las células o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.

Etapas en la extracción deADN

Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son:

1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró-picas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

3. Purificación. Consta de 3 fases:

• Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.

• Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse

• Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos

El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido Inhibidores de la PCR. Se trata de substancias que interfieren con las ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su actividad catalítica o mediante la unión directa al ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas substancias interaccionan con los iones Mg2+

La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR.

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