Extracción De Adn

Introducción

El análisis de la molécula de ADN constituye una herramienta muy valiosa que ha permitido delinear estrategias aplicadas a la investigación básica y al diagnóstico de entidades de origen genético. El ADN puede ser extraído de innumerables tipos de material biológico, y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos de cantidad, calidad y pureza; es necesario separar el ADN del resto de los componentes celulares así como del material no biológico que pueda estar presente (Mendoza, 2010).

Los protocolos de extracción buscan, en general, eliminar potentes inhibidores de reacciones de amplificación que eviten o dificulten análisis posteriores. El proceso general de aislamiento involucra tres pasos: primero, la lisis de membranas celulares, mediante el uso de buffer específico y altas temperaturas; segundo, la degradación de las proteínas por incubación y proteinasa K; tercero, la extracción de ADN y su precipitación mediante el uso de alcoholes (Mendoza, 2010).

Objetivo

Que el alumno conozca los fundamentos básicos de la extracción de ADN en diferentes organismos y la importancia de cada paso del protocolo.

Materiales y métodos

Extracción de ADN animal (pollo y camarón)

ﻭ Kit extracción de ADN “QIAamp DNA mini kit”.

ﻭ Pistilos estériles.

ﻭ Micropipetas de 1000µl, 200µl y 10µl.

ﻭ Puntas para micropipetas de 1000µl, 200µl y 10µl estériles.

ﻭ Microtubos de 1.5ml estériles.

ﻭ Espectrofotometro Nanodrop.

ﻭ Tejidos Carne de res o pollo y marisco.

ﻭ Agarosa

ﻭ Cámara para electroforesis en Agarosa

ﻭ Buffer TAE

ﻭ Transiluminador UV

1. Pesar 25mg de tejido y homogenizar con pistilo estéril y 80µl PBS, posteriormente añadir 100µl de buffer ATL y agitar al vórtex.

2. Añadir 30µl de proteinasa K, mezclar con vortex e incubar toda la noche a 56°C.

3. Añadir 200µl de buffer AL, mezclar por 15 seg con vortex e incubar 10 min a 70°C.

4. Añadir 200µl de etanol absoluto y mezclar con vorftex.

5. Añadir toda la mezcla a la columna y centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 minuto a 4°C. Descartar lo que paso por la columna al tubo colector.

6. Añadir 500µl de buffer AW1, centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C, descartar lo que paso por la columna al tubo colector.

7. Añadir 500µl de buffer AW2, centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C. Descartar lo que paso por la columna al tubo colector y volver a centrifugar.

8. Colocar la columna en un microtubo de 1.5ml estéril y añadir a la columna 200µl de buffer AE o agua estéril. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C. Repetir este paso añadiendo 100µl de buffer AE o agua estéril.

Extracción de ADN vegetal (Lantana sp.)

Aislamiento de ADN Genómico (Basado de Lópes et al., 1995.Molec. Genomic Genetic.247: 603-613; Modificado por Hernández Godínez Fernando, 2008).

1. Moler 20mg (0.5gr-1gr) de tejido fresco previamente congelado con nitrógeno líquido.

2. Agregar 600µl (15mL) de buffer de lisis (Tris-HCl 100mM a pH 8.0, NaCl 20mM, EDTA 20mM, y N- Lauril sarcosina al 1%) a tubo falcon de 50mL, así como el polvo molido. Invertir hasta humedecer el polvo y dejar reposar por 10 minutos. Para agilizar proceso se sustituye el paso 5. Aqui se agrega la RNAsa se deja reposar a temperatura ambiente.

3. Agregar 600µl (15mL) de fenol (equilibrado con tris) y vortear.

4. Equilibrar en balanza los tubos (con fenol) y centrifugar por 20 minutos a 4°C a 12,000rpm.

5. Retomar la fase acuosa y transferir a otro tubo, agregar 5µl (10µl) de RNAsa (10mg/mL). Mezclar por

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