Extracción De ADN

PARTE I

Objetivo: - Conocer los procedimientos básicos para purificar y extraer DNA.

- Conocer las diferentes funciones que tienen cada reactivo en la extracción de DNA.

1. Explique las características químicas, físicas y estructurales del DNA.

2. Mencione y explique al menos dos formas de extracción y purificación del DNA de cualquier muestra (tejido animal, tejido vegetal, bacterias, levaduras, entre otros).

Método Salting Out: es una técnica orgánica, que utiliza reactivos bajos en toxicidad y que permite visualizar perfectamente la cadena de ADN, aunque requiere una mayor cantidad de muestra

En este método se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K (Tris-HCl, pH 8.3, Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones.

Método de chelex: esta es una técnica inorgánica que proviene de la degradación del ADN por lo que la muestra se conserva mas tiempo, y los reactivos con los que se realiza no son tóxicos. Además, no se pierde nada de ADN en el proceso. El procedimiento de extracción de ADN del corte histológico del bloque de parafina fue llevado a cabo utilizando 150 µL de una solución de Chelex-100 (Sigma-Aldrich, USA) al 5% y calentando a 100°C por 30 minutos. Luego se centrifugó a 13.000 rpm por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo de 0,5 mL estéril, sin tomar la resina quelante para evitar inhibición de la RCP (12).

El método de fenol-cloroformo: esta es una técnica orgánica, que obtiene gran cantidad de ADN de muy buena calidad. Además después de la prueba, el fenol y el cloroformo pueden ser recuperados y reutilizados. Sin embargo, los reactivos son altamente tóxicos, es una de las técnicas mas lentas y se pierde mucho ADN.

3. Señale la función de los siguientes componentes utilizados en el protocolo a seguir en el laboratorio de extracción de DNA.

• Sal: se utiliza cloruro de sodio (NaCl) para que sus iones sodios (Na+) interactúen con los grupos fosfatos cargados negativamente del DNA para que estos no interaccionen con el agua (H2O) y de esta forma el DNA se vuelva insoluble y puede precipitar.

• Licuadora: al moler la hoja de acelga facilita la destrucción de la pared celular, membrana plasmática y nuclear así liberando el DNA de estas envolturas.

• Detergente: se utiliza para solubilizar los componentes más abundantes de la célula que son las proteínas.

• Jugo de lechosa: la piña tiene una muy especial, esta enzima se llama bromelina. La bromelina es muy apreciada ya que esta última acciona

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