Laboratorio de Enzimología

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Vida[pic 1]

Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio y Seminario de Bioquímica General Biol 261

Laboratorio de Enzimología

Profesores

Ximena Ortega Gian Franco Pietrantoni

Integrantes Antar Muñoz Enrique Godoy Francisca Fuenzalida

Sección

301

Introducción:

Las enzimas son moléculas que catalizan reacciones químicas, es decir aceleran la velocidad a la que ocurren dichas reacciones, son generalmente de naturaleza proteica aunque también existen algunas de ácidos ribonucleicos llamadas ribozimas (Cardona Serrate, F. 2020), en el presente informe se estudiarán los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida la cual es una enzima presente en el germen de trigo y cataliza la hidrólisis de monoésteres de fosfato generando la liberación de fosfato inorgánico y un alcohol, los parámetros que se estudiaran para analizar la cinética de esta enzima son temperatura óptima y Ph óptimo de funcionamiento.

La técnica a utilizar aprovecha la especificidad de la enzima por el sustrato p-Nitrofenilfosfato que es incoloro. La reacción enzimática da como producto p-nitronifenil que en medio alcalino es p-nitrofenolato, tornandose de color amarillo, el cual absorbe luz a una longitud de onda de 405 nm, haciendo posible hacer mediciones espectrofotometricas para la posterior cuantificación del producto. Con estos datos se logra hacer un análisis de la actividad enzimática en relación a los distintos parámetros de temperatura y potencial de hidrógeno a los que será expuesta la enzima

La importancia de conocer el Ph óptimo de cualquier enzima radica en que la pérdida de la estructura nativa produce una pérdida en la actividad catalítica debido a la denaturación, la cual puede ser reversible o irreversible,   son agentes desnaturalizantes el calor, la presión, los valores de pH extremos, altas concentraciones de sales, detergentes y agentes caotrópicos (Cardona Serrate, F. 2020). Ahora bien, se sabe que la enzima fosfatasa ácida requiere un pH ácido para su actividad catalítica. Cabe decir, que se ha encontrado en la fosfatasa ácida de garbanzo una actividad enzimática máxima a pH 5,0 (Asaduzzaman A. et al. 2011).

Dentro de los parámetros cinéticos que se determinarán en la fosfatasa ácida se encuentran:

La velocidad máxima de la enzima y la constante de Michaelis, los cuales se calculan por medio de la ecuación de Michaelis-Menten y de Lineweaber-Burk. La ecuación de Michaelis-Menten, es la ecuación de velocidad de una reacción enzimáticamente con un sustrato, en otras palabras, es la relación cuantitativa entre la velocidad inicial (V0) , la velocidad máxima (Vmax) y la concentración inicial de sustrato, todo esto integrado a la constante de Michaelis- Menten. La constante de Michaelis o km equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima, indicando la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km (Nelson David, Cox Michael. 2009). Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato (S.A. 2005).

Objetivos:

• Determinación de curva de progreso de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

• Determinación del pH óptimo aproximado de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

• Determinación de temperatura óptima aproximada de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

Materiales y métodos:

Actividad 1

• Metertek modelo SP-830
• HS-2 Water bath
• 15 tubos de ensayo
• 3 cubetas de espectrofotómetro
• 1 micropipeta de 100-1000μl
• 1 micropipeta de 20-200μl
• 1 micropipeta de 0-20μl
• agua destilada
• propipeta
• p-nitrofenol 60 μM
• solución de p-nitrofenolfosfato 25 mM
• solución amortiguadora de citrato de sodio 0,1 M-EDTA 0,15 M pH 5,0
• solución de NaOh 0,1 M
• solución de NaOh 0,02 M
• Enzima 5 mg/mL en BSA 0,1%

Actividad 2

• Metertek modelo SP-830
• HS-2 Water bath
• 20 tubos de ensayo
• 3 cubetas de espectrofotómetro
• 1 micropipeta de 100-1000μl
• 1 micropipeta de 20-200μl
• 1 micropipeta de 0-20μl
• agua destilada
• propipeta
• p-nitrofenol 60 μM
• solución de p-nitrofenolfosfato 25 mM
• solución amortiguadora de citrato de sodio 0,1 M pH 7,09
• solución amortiguadora de citrato de sodio 0,1 M-EDTA 0,15 M pH 5,0
• solución de NaOh 0,1 M
• Enzima 5 mg/mL en BSA 0,1%

-        BSA 0,1%

Actividad 1

Determinación de curva de progreso de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

En un principió, se prepararon 6 tubos de ensayos para formar la curva estándar de p-nitrofenol, a los cuales se les agregó 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; y 2,5 mL de p-nitrofenol 60 μM respectivamente y se llevó a volumen final de 3 mL con NaOH 0,02 M. Luego de esto se midieron sus absorbancias a una longitud de onda 405 nm usando el tubo sin p-nitrofenol como blanco, las cuales se graficaron con las concentraciones calculadas de p-nitrofenol de cada tubo para calcular los μmoles / L de producto en la siguiente actividad.

A continuación se trabajó para crear una curva de progreso de la fosfatasa ácida de germen de trigo preparando un tubo con 2 mL de amortiguador citrato de sodio 0,1 M-EDTA 0,15 M pH 5,0 y 2 mL de p-nitrofenilfosfato 25 μM e incubando a 37°C(tubo de reacción). Luego de esto se le agregó 1 mL de la enzima diluida al tubo de reacción, se agitó y se sacó una alícuota de 0,5 mL para depositarla en un

tubo previamente preparado con 5,5 mL de NaOH 0,1 M, proceso el cuál se repitió a los 15, 30 y 40 minutos. A cada una de estas 4 soluciones de 5,5 mL de NaOH con 0,5 mL del tubo de reacción se les midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm usando el control de tiempo 0 como blanco, las cuáles, usando la curva estándar se pudo calcular la concentración de producto, con el cuál se pudo graficar una curva de progreso de producto (M) vs minutos, que refleja el progreso de la reacción enzimática.

Actividad 2

Determinación del pH óptimo aproximado de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

Se preparó un tubo con 2 mL de solución amortiguadora de citrato de sodio 0,1 M pH 7,09 y 2 mL de p-nitrofenilfosfato 25 μM y se incubó a 37°C (tubo de reacción). A continuación se le agregó 1 mL de enzima diluida en BSA 0,1%, se agitó y se sacó una alícuota de 0,5 mL agregandolo a un tubo previamente preparado d}con 5,5 mL de NaOH 0,1 M, proceso el cuál se repitió a los 15, 30 y 40 min, y se les midió su absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el control de tiempo 0 como blanco. Usando la curva estándar de la actividad anterior se determinaron los μmoles / L de p-nitrofenol producido para el pH trabajado y para los de nuestros compañeros (4,01; 5,0; 5,62; 6,0 y 7,09), los cuales nos ayudaron a realizar un gráfico que refleje el progreso de la reacción enzimática ([producto] en el tiempo) y así poder determinar V0 para posteriormente generar un nuevo gráfico de log V0 en pH para establecer el pH óptima aproximado de la Fosfatasa ácida.

Determinación de temperatura óptima aproximada de la Fosfatasa ácida de germen de trigo

Se prepararon 2 tubos de reacción con 2 mL de solución amortiguadora de citrato de sodio 0,1 M-EDTA 0,15 M pH 5,0 y 2 mL de p-nitrofenilfosfato 25 μM y se incubaron a 37°C. A uno se le agregó 1 mL de una solución diluida 1/20 de enzima 5 mg/mL en BSA 0,1% y al otro tubo de

reacción 1 mL de BSA 0,1% sin enzima. A ambos se les agitó y se le sacó a cada uno una alícuota de 0,5 mL para depositarlo en tubos ya preparados con 5,5 mL de NaOH 0,1 M, proceso que se repitió para ambos tubos de reacción a los 15, 30 y 40 min. Se les midió su absorbancia a una longitud de onda de 405 nm y usando la curva estándar generada en la primera actividad se calcularon los μmoles / L de p-nitrofenol producidos en ambos procesos, y juntando los datos de concentraciones generadas a diferentes temperaturas (1°C; 22°C; 37°C; 40°C; 45°C y 50°C) entregadas por los compañeros del laboratorio se graficó de V0 vs temperatura de incubación para generar un nuevo gráfico que determine la temperatura óptima aproximada de la fosfatasa ácida.

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