MESOFILAS AEROBIAS

METODO DE RECUENTO DE MESÓFILAS AEROBIAS EN ALIMENTOS EN PLACA PETRIFILM

Redactado por: Revisado por: Aprobado por:

Resp. Área de Microbiología

Lic. Rolando Ledezma Unzueta <Comité SGC> Enc. Laboratorio Bromatológico

Ing. Kathia Soto Castellón

Fecha Fecha Fecha

1. OBJETIVO

Describir la metodología del ensayo para el recuento de Aerobias Mesófilas en alimentos y bebidas según lo establece la NB 32016.

2. ALCANCE

Se aplica para ensayos microbiológicos en alimentos y bebidas a excepción del agua.

3. REFERENCIAS

Nº Código Título

1 PG-MB-01 Procedimiento general para la realización de ensayos Microbiológicos

2 PG-MB-06 Preparación y dilución de las muestras de alimentos para su análisis microbiológico

3 IT-MB-01 Campana de flujo laminar

4 IT-MB-05 Uso del Agitador Vortex

5 IT-MB-07 Manejo de la Estufa de Incubación a 35 OC

6 IT-MB-10 Uso del Microondas

7 IT-MB-11 Manejo del Stomacher

8 IT-MB-12 Manejo de la Autoclave de esterilización de materiales y medios de cultivos

9 IT-MB-14 Uso del Contador de colonias

10 IT-MB-20 Uso de la Heladera para almacenamiento de medios de cultivos

11 IT-MB-23 Uso del Pipeteador automático

12 IT-MB-25 Preparación de medios de cultivos, diluyentes y reactivos

4. TERMINOS Y DEFINICIONES

4.1 Placas Petrifilm para Recuento de Mesófilos Aerobios.

Es un medio de cultivo listo y preparado para su uso; Contiene nutrientes estándares como: agar standard methods, un agente gelificante soluble en agua fría y un tinte o indicador de cloruro 2, 3, 5-trifeniltetrazolio (tetrazolium) de color rojo que facilita la enumeración o el recuento de las colonias de una población total existente de bacterias aerobias en productos, superficies, etc. El área de crecimiento circular de cada placa contiene cerca de 20 cm2 en la ase de la película.

4.2 Difusor plástico.

Diseñado para distribuir o esparcir la muestra de prueba de manera uniforme en el área de crecimiento de la placa, consiste de un lado hueco rugoso y un lado suave, liso y plano.

4.3 Bacterias Mesófilas.

Son bacterias cuya temperatura de desarrollo están comprendida entre 20 – 40ºC. Temperatura optima 35ºC.

4.4 Recuento total de bacterias Aerobias Mesófilas.

Indica la presencia de la flora total sin especificar los tipos de bacterias, también determina la calidad sanitaria y la vida útil de los alimentos o productos, indicando las condiciones de higiene de la materia prima, la forma como fueron procesados y la manipulación durante su elaboración y comercialización. Sigue siendo uno de los indicadores más útiles del estado microbiológico de un alimento, ya que un recuento elevado predice la posibilidad de que el alimento se descomponga.

4.5 Contador de colonias.

Aparato estándar, del cual se prefiere el modelo Quebec, o uno que proporcione un aumento y la visibilidad equivalentes.

5. PRINCIPIO

Este método utiliza placas de medios seco rehidratable (gel soluble en agua fría), donde se añaden o inoculan suspensiones diluidas de 1 ml por placa, aplicar presión al difusor de plástico sobre la película superior para esparcir la muestra diluida en toda el área de crecimiento (20cm2), esperar que el agente gelificante se solidifique, después incubar las placas a 35ºC +/- 2ºC, a 48 hrs. Luego de la incubación se forman colonias visibles y separadas donde se calcula el número de bacterias aerobias Mesófilas por UFC x g o mL de alimento de acuerdo a las diluciones requeridas.

6. RESPONSABILIDADES

a. Responsable de Ejecución: Analista

b. Responsable de Control: Encargado del Área de Microbiología.

c. Responsable de Verificación y Correcciones: Coordinador técnico.

7. MATERIALES, INSTRUMENTOS, EQUIPOS Y REACTIVOS

7.1. Materiales

• Pipeta de 1 ml.

• Tubos de ensayo de 12 a 15 ml.

• Pro-pipetas de 1ml y 2ml.

• Bolsas Stomacher estériles.

• Difusor plástico y/o aplicador Petrifilm de base rugosa.

• Termómetro.

• Marcador permanente.

7.2. Instrumentos y Equipos

• Estufa de Incubación a 35 ºC ± 2OC.

• Contador de colonias.

• Pipeteador automático

• Cronometro digital

• Campana de flujo laminar o CSB.

• Agitador Vortex.

• Stomacher.

• Calentador o microondas.

• Heladera y/o congelador.

• Balanza analítica.

7.3. Reactivos

• Placas Petrifilm para recuentos de Mesófilas aerobias.

• Agua Peptonada al 0.1%

• Alcohol gel al 70 %

8. PROCEDIMIENTO

8.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

8.1.1 Diluyentes (Para diluir la muestra y realizar las diluciones) Utilizar:

• Agua destilada

• Agua de peptona al 0.1%

• Solución salina (0.85-0.90%)

• Caldo letheen sin bisulfito

• Agua de peptona tamponada/agua peptonada buferada método ISO 6579)

• Solución salina de peptona (método ISO 6887)

• Tampón fosfato de Butterfield (método ISO 5541-1)

Nota. No utilizar diluyentes que contengan citratos, bisulfitos o tiosulfato en las placas petrifilm ya que pueden inhibir el crecimiento bacteriano.

Ver Preparación de medios de cultivos, diluyentes y reactivos (IT-MB-25).

8.1.2 Homogeneización de la Muestra.

Ver Preparación y dilución de las muestras de alimentos para su análisis microbiológico (PG-MB-6)

8.1.3 Ajuste de Ph.

Ver PG-MB-6 Preparación y dilución de las muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

8.2.3 PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES

Ver Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico (PG-MB-06).

Nota. Trabajar bajo la cabina de flujo laminar

8.3.3 INOCULACIÓN (REALIZADA POR DUPLICADO)

• Coloque la Placa 3M Petrifilm para el recuento de AC sobre una superficie plana, lisa y nivelada.

• El área de inoculación de Petrifilm AC es de 20 cm2

• Levante la lámina semitransparente superior y con la pipeta perpendicular dispense 1 mL de la muestra en el centro del botón de la lámina o película inferior. Asegurándose de no tocar la placa con la punta de la pipeta.

• Libere o deje caer la lámina o película superior sobre la dilución de la muestra. No deslice hacia abajo.

• Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor de plástico en el centro de la placa sobre la película superior.

• Presione cuidadosamente sobre el centro para distribuir la muestra, sobre el área circular o de crecimiento de la placa Petrifilm antes de que se forme el gel. No gire ni deslice el dispersor a través de la lámina.

• remueva o levante el esparcidor de la placa. Espere por lo menos 1 minuto a que se gelatinice o solidifique el gel de la placa y proceda a la incubación. Ver anexo 1

8.4.3 INCUBACIÓN

• Incube las placas horizontalmente cara arriba y no más de 20 placas unas sobre otras. Puede ser necesario humectar el ambiente de la incubadora con un pequeño recipiente con agua estéril, para minimizar la perdida de humedad.

• El tiempo de incubación y la temperatura varían según el método.

Métodos Oficiales Validados más utilizados

• AOAC método oficial (986.33 método de lamina rehidratante para recuentos de bacterias aerobias mesófilas en leche & 989.10 método de lamina rehidratante para recuentos de bacterias Aerobias Mesófilas en productos lácteos).

Incubar las Placas Petrifilm AC por 48 h +/- 3 h a 35 ºC +/- 1 ºC.

• AOAC método oficial (990.12 método de lamina seca rehidratable para recuento de placas de aerobios en alimentos).

Incubar las Placas Petrifilm AC por 48 h +/- 3 h a 35OC+/- 1 ºC.

• AFNOR método validado (método comparativo de recuento total de aerobios e ISO 3M 01/1-09/89 para todos los alimentos). Incubar las Placas Petrifilm AC por 72 h +/- 3 h a 30 ºC +/- 1 ºC.

• Método MNKL 146.1993 Incubar 72hr +/- 3hrs a 30OC.

8.5.3 INTERPRETACIÓN

• Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias estándar u otro tipo de lupa con luz. Consulte la Guía de interpretación para leer los resultados.

• Enumere todas las colonias de color rojo o rosado, sin tomar en cuenta su intensidad de color y tamaño.

• El rango recomendado de conteo en la placa petrifilm AC está entre 25-250 colonias. Actualmente es de 30-300 colonias.

• El área de crecimiento circular es de aprox. 20cm2, la cual puede ser estimada sobre las placas que contengan un crecimiento mayor a 300 colonias por su excesivo crecimiento contando dos o más cuadritos representativos, determinándose además un número promedio por cm2, multiplique el número promedio por 20 y determine el conteo estimado total para cada placa.

• Altas concentraciones de colonias sobre las placas petrifilm para recuento de aerobios AC pueden desarrollarse sobre todo el área de crecimiento presentándose de color

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