PRACTICA NO.4: VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS (DNA) MEDIANTE LA ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA

BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR

PRACTICA NO.4: VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS (DNA) MEDIANTE LA ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

NOMBRE:               CODIGO:[pic 1]

OBJETIVO:

• Desarrollar habilidades para la preparación de geles de agarosa y electroforesis de moléculas de DNA  

INTRODUCCION:

La electroforesis es una técnica usada para la separación de moléculas según la movilidad de las mismas en un campo eléctrico a través de un gel compuesto de una molécula orgánica como agarosa o poliacrilamida sobre la superficie hidratada de un soporte sólido como acetato de celulosa o bien en dilución (electroforesis libre).

La separación por electroforesis obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas u a su masa. Así se hace correr la muestra de DNA a través del tamiz o gel y dependiendo de su resistencia al pasar se separan las moléculas.

 MATERIALES:                                              [pic 2]

• Cámara de electroforesis          
• Porta geles
• Microondas
• Micro pipetas
• Probeta de 100ml
• Cinta parafina

METODOLOGIA:

Se prepara la porta gel sellando los bordes con cinta de enmascarar reforzando en la base. A continuación se coloca el peine a una distancia de 0.5cm aproximadamente cerca al extremo izquierdo para formar los pozos se elige el peine según el número de muestras a correr. En la preparación de la gel agarosa se pesó en la balanza la cantidad requerida del polvo de agarosa se aforo con buffer TBE 0.5 hasta el volumen necesario luego se procedió a llevar al microondas por aproximadamente un minuto hasta homogenizar la mezcla, se dejó enfriar a temperatura ambiente. La cantidad de buffer y agarosa utilizada en la preparación del gel fue 0,4 gramos, 100ml TBE luego se añade 2 ul de gel red por cada de agarosa y en seguida vaciamos la solución de agarosa dentro del soporte del gel, con cuidado se dejó que se solidifique. El gel contenido en el soporte se monta dentro de la cámara de electroforesis con los pozos en el lado del electrodo negro, cuando ya estuvo montado se añadió el tampón TBE hasta cubrir el gel y por último se quitó cuidadosamente el peine. Para la preparación del DNA problema se mesclo con buffer de carga, con una micro pipeta en un trozo de papel parafina, donde se forman gotas de 2ul de buffer de carga y posteriormente se cargaron estas muestra en los pozos de el gel con la micro pipeta. En el primer pozo se añade el marcador del peso molecular, luego procedimos con el corrido de la electroforesis que después de cerrar la cámara se conecta el cátodo (negro) del lado de las muestras y el ánodo (rojo) del otro lado, se aplicó 100 voltios y 400 amperios por media hora. Final mente se obtienen los resultados en imagen por computación y se observa y se saca conclusiones.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

La electroforesis en geles de agarosa es una técnica de gran importancia en la biología molecular. Este método analítico en el que se separan las moléculas de interés. Los fragmentos de DNA migran hacia un polo opuesto según las cargas eléctricas de estas, si la carga es negativa la molécula migraran hacia el cátodo y si es positiva hacia el ánodo.

En la práctica de laboratorio se realizó la electroforesis de un ADN bacteriano, sin embargo este se encontraba contaminado con partículas de RNA por lo cual no se podría obtener unos correctos resultados, de tal manera que analizamos otros resultados anteriores presentados en la gráfica de geles 1 y 2.

Como se puede observar en las figuras las sustancias que se encontraban en los

Pozos migraron luego de aplicarle fuerza eléctrica, los pozos de las esquinas contienen el marcador de peso molecular que funciona   como   un   patrón   para   comparar el resultado de los pares de base de la muestra, desde 100 a 1,100 pares de bases. Este marcador es ideal para la determinación del tamaño de fragmentos de ADN.

En el gel 1 se observa empezando de izquierda, que los pozos 1 y 3 pesan lo mismo con un valor de 400pb y el pozo 2 que es el de mayor peso con 700pb con respecto a los anteriores pozos el 4, 5 y 6 pesan aproximada mente 200pb el peso más bajo se puede decir que hay una uniformidad en los pesos de estos pozos.

En el gel 2 notamos una variedad de pesos en todos los pozos, desde el más alto hasta el más bajo, dando el aspecto lineal de descenso de izquierda a derecha, el pozo 1 con el peso más alto de aproximadamente 800pb consiguiente a este los demás pozos descienden en un rango de 100 a 150pb por cada pozo que avanza hacia la derecha hasta llegar al pozo 6 con 100pb.

La muestra migra hacia el lado positivo de la cámara debido a los grupos fosfatos que le dan una carga negativa al ADN haciendo que migre hacia el ánodo de la cámara. La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis debido a esto las moléculas con menor tamaño migran con mayor rapidez hacia el polo positivo de la cámara, y al aumentar la concentración de agarosa (poro pequeño) es más difícil el movimiento a través del gel de esta manera se pueden identificar los fragmentos con bajo peso molecular. Y gracias al SYBER safe que sirve como colorante se puede visualizar y comparar con el marcador de peso molecular al colocar en el transluminador.

Respecto a los DNA obtenidos en la práctica número 3 que no pudieron ser usados para el análisis, dado que estos estaban contaminados con rastros de RNA. Cuando se extrae el DNA plasmídico de las bacterias, obtenemos algo que consideramos un producto purificado, pero habitualmente habrá moléculas de plásmido en dos o tres   conformaciones,   formas   topológicamente   diferentes. Conocidas como superenrollada, relajada y lineal de longitud completa, corresponden a la misma molécula y tienen todas el mismo número de pares de bases (o “longitud” de  la  molécula),  pero  tienen  diferente  forma,   por  lo  que   ocupan  un  volumen efectivo   diferente   y   avanzan   por   el   gel   a   distinta   velocidad. El   ADN superenrollado viaja más rápido por el gel de agarosa que el ADN relajada y lineal

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