PRÁCTICA 8 REACCIONES ENZIMÁTICAS DE OXIDO-REDUCCIÓN
Enviado por fpsilva.140900 • 12 de Abril de 2021 • Apuntes • 1.172 Palabras (5 Páginas) • 405 Visitas
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS E INGENIERÍA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA METABOLICA
PRÁCTICA 8 REACCIONES ENZIMÁTICAS DE OXIDO-REDUCCIÓN
PRÁCTICA 9 EFECTO DE COFACTORES E INHIBIDORES EN LA RESPIRACIÓN
OBJETIVO
Que el alumno compruebe la actividad enzimática de la deshidrogenasa láctica y deshidrogenasa succínica sobre un fragmento de músculo, así como la acción de cofactores e inhibidores.
INTRODUCCION
Todas las manifestaciones vitales requieren energía, la cual se obtiene por la oxidación gradual de los alimentos ya que los procesos de oxido-reducción hay transferencia de energía debido a las diferencias de potencial eléctrico. Un sistema de potencial elevado oxida al de más bajo potencial con la consiguiente liberación de energía para las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxido-reducción hay transferencia de electrones. La oxidación se define como la pérdida de electrones, mientras que la reducción es la ganancia de electrones. Por tanto, la oxidación y reducción son fenómenos que se realizan simultáneamente.
La oxidación biológica implica transferencia de hidrógenos a través de una serie de sistemas enzimáticos que actúan como intermediarios para llegar al aceptor final de electrones que es el oxígeno. El proceso oxidativo se inicia por la acción de una deshidrogenasa específica, que no reacciona directamente con el oxígeno sino que requiere de intermediarios como NAD⁺, flavoproteínas y citocromos.
En la presente práctica se realizará el estudio de 2 deshidrogenasas y de dos oxidasas que actúan como intermediarios en el transporte de electrones, el efecto inhibidor de cianuro y malonato, así como los cofactores de dichas enzimas.
MATERIAL Y REACTIVOS:
- Tubos de ensaye de 16 x 150 mm
- Pipetas graduada 1, 5 y de 10 ml
- Bureta de 25ml
- Vasos de precipitados
- Mortero
- Tijeras
- Matraz Erlenmeyer de 250 ml
- Vaso de precipitado de 100 ml
- Baño de agua
- Termómetro
- Arena lavada
- Solución d NaCl al 0.9%
- Solución de KCN al 0.5 % y al 0.01%
- Solución de Lactato de sodio al 1%
- Solución de Azul de metileno al 2 mM
- Nujol
- Solución de Na2HPO4 al 0.06M
- Solución de Ácido succínico 0.1 M
- Solucion de Malonato de sodio 0.1 M
- Solución p-fenilendiamina al 1% (recién preparada)
- Solución alfa-naftol al 0.15% en alcohol
- Musculo de patas traseras de carnero
- Bisturí
- Parilla Eléctrica
- Hielera
- Hielo
- Balanza
- Espátulas
TÉCNICA
- Preparación del sistema deshidrogenasa láctica-NAD+
- Preparación de la enzima
1-. Pesar de 2 a 3 g de músculo de las patas traseras.
2-. Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlos en agua a ebullición por 5 minutos en un vaso de precipitado de 100 ml (en proporción de 8 ml de H2O por gr de músculo).
3-. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena (aproximadamente 1 gr) y macerar bien el músculo.
4-. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como coenzima (NAD⁺). El precipitado se desecha.
- Preparación de la enzima (LDH)
1-. Colocar de 2 a 3 gr de músculo de las patas traseras en un mortero previamente sumergido en hielo y adicionar solución de NaCl al 0.9% (en proporción de 10 ml por gramo de músculo). Agregar un poco de arena (aproximadamente 1 gr) y macerar perfectamente.
2-. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 minutos (mantener en frio).
3-.Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como “Deshidrogenasa Láctica” (LDH) y mantener en frio. El precipitado se desecha.
- Preparación de la deshidrogenasa succínica y citocromos
1-. Pesar 3 g de corazón y cortarlo en fragmentos pequeños y ponerlo en un mortero previamente sumergido en hielo, adicionando un poco de arena (aproximadamente 1 gr) y de solución fría de Na2HPO4 0.06 M en una proporción de 8 ml por gramo de corazón y macerar perfectamente.
2-. Diluir la mezcla agregando 16 ml de Na2HPO4 0.06 M por gramo de corazón.
3-. Dejar reposar la mezcla por 30 minutos con agitación ocasional, en frio.
4-. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como “Deshidrogenasa SuccínicaCitocromos DSC”, mantener en frio. El precipitado se desecha.
- Determinación de actividad enzimática
Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos, preparar las 3 series siguientes en tubos de ensaye etiquetados, como se indica a continuación:
ATENCION: TRABAJAR LAS SOLUCIONES DE KCN CON MUCHA PRECAUCION, YA QUE ES UNA SUSTANCIA ALTAMENTE PELIGROSA. NO SE DEBE UTILIZAR PIPETA; MANIPULAR DICHA SUSTANCIA CON BURETA Y LAVARSE LAS MANOS.
1-. DESHIDROGENASA LACTICA
Tubo # | 1 | 2 | 3 | 4 |
KCN 0.5% (ml) | 1 | 1 | 1 | 1 |
Lactato 1% (ml) | 1 | 1 | 0 | 1 |
Azul de metileno 2 mM (ml) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
Agua (ml) | 1 | 0 | 1 | 1 |
Sobrenadante coenzima (ml) | 0 | 1 | 1 | 1 |
Sobrenadante LDH (ml) | 1 | 1 | 1 | 0 |
Lecturas: Inicial, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, etc. |
Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0 ml de nujol. Incubar a baño maría a 37º C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en los cuadros los grados de “decoloración” con signos “+”y con “0”la falta de la misma.
2-. DESHIDROGENASA SUCCINICA
Tubo # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
Succinato de sodio 0.1M (ml) | 0.5 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 1 |
Azul de metileno 2 mM (ml) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
Malonato de sodio 0.1 M (ml) | 0 | 0 | 0 | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
Agua (ml) | 1 | 1.5 | 3 | 0 | 0.5 | 0.75 | 0.25 |
Sobrenadante "DSC "(ml) | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Lecturas: Inicial, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, etc. |
Mezclar bien el contenido de cada tubo y añadir a todos 1.0 ml de nujol. Incubar en baño maría a 37º C y hacer lecturas a los tiempos señalados anotando en el cuadro los grados de “decoloración”con signos “+”y con “0” la falta de la misma.
3-. CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA
Tubo # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
KCN 0.01 % | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
p-fenilendiamina 1.0% (ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Alfa-naftol 0.15% (ml) | 0 | 0 | 0 | 0.1 | 0.1 |
Agua (ml) | 1.1 | 0.1 | 2.1 | 1 | 1 |
Sobrenadante "DSC"(ml) | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
Lecturas: Inicial, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos 90 minutos, etc. |
Mezclar bien el contenido de todos los tubos e incubar a 37º C en baño de agua con agitación ocasional. Hacer lecturas a los tiempos señalados anotando en el cuadro los cambios de “color” de las soluciones.
PREPARACION DE SOLUCIONES Y REACTIVOS
1.-NaCl al 0.9 %. Pesar 0.9 gr y aforar a 100 ml con agua destilada.
2.- KCN al 0.5 %. Pesar 0.5 gr de cianuro de potasio y aforar a 100 ml con agua destilada.
3.- KCN al 0.01 %. Pesar 0.01 gr de KCN y aforar a 100 ml con agua destilada.
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