PRÁCTICA Nº 7 PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

PRÁCTICA  Nº  7

PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

I.- OBJETIVOS

Conocer las manifestaciones de los microorganismos al realizar pruebas bioquímicas.

II.- REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

Las colonias sospechosas de E. coli, Salmonella, Shiguella, etc. que se encuentran en placas de siembra directa (VRBA, EMB, XLD) serán transferidas en su oportunidad a los medios de diferenciación bioquímica primaria. Las pruebas son numerosas. En los laboratorios hospitalarios no se justifica el empleo de muchas pruebas bioquímicas, puede utilizarse el uso de medios como: el TSI (triple azúcar fierro), LIA (agar Lisina fierro) y el indol;  para el caso de un laboratorio de microbiología de alimentos se usan el INVIC (indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato de Simons); para confirmar la presencia de E. coli. Otras pruebas que superan los 50 deben ser hechas a otros niveles, tales como, en un laboratorio de Referencia.

TSI.- Este medio está compuesto por tres azúcares que son: la glucosa, lactosa y sacarosa.

El fierro es el indicador para poner en evidencia, la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S).

El color original de este medio es rojo ladrillo (pH 7.4).

• La producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) se manifiesta por el color negro en el medio. Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 4+.
• La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio. Se simboliza según su intensidad de 1+ a 4+.
• La acidez se pone de manifiesto por su cambio de color amarillo y se simbolizará con la letra A.
• La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color grosella y se simboliza con la letra K.
• El ataque de glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A). Se simboliza K/A.
• El ataque de la lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total o medio al color amarillo. Se simbolizará A/A.

LIA.-Puede utilizar la lisina, del medio LIA, por los mecanismos de descarboxilación, desaminación, o bien ser negativos frente a este aminoácido. Para diferenciar estas reacciones el medio tiene en su composición glucosa y el indicador azul de bromocresol.

El color original del medio  es ligeramente azulado (pH 6.7)

La descarboxilación de la lisina produce alcalinidad en todo el medio, por lo tanto el color azulado se intensifica. Se simboliza K/K. Este tipo de reacción se considera como LISINA POSITIVA.

La desaminación empieza en la parte inclinada, variando esta porción al color rojo ladrillo. El fondo del medio se tornará amarillo. Esta reacción se interpreta por motivos prácticos como LISINA NEGATIVA. Se simbolizará R/A.

En los casos en que no se produce ninguna de las dos reacciones descarboxilación o desaminación, el medio LIA se observará azulado en la parte inclinada y amarillo en el fondo por fermentación de la glucosa. Esta reacción se simboliza K/A., a veces el medio puede presentarse amarillo en su totalidad, simbolizándose A/A. Estas dos lecturas así simbolizadas se interpretarán, como LISINA NEGATIVA de tal manera que la reacción negativa a la lisina se simbolizará: R/A; K/A o A/A.

La reacción del indol se interpretará como positiva por la aparición del color rosado en la tira del papel filtro, colocado en la boca del tubo. El símbolo positivo (+) o negativo (-) correspondiente a la lectura del indol, se simbolizará en la reacción en LIA.

En los casos en los que el color del medio LIA no haya variado sustancialmente a pesar del crecimiento bacteriano, se representará N/N.

Esto se puede presentar por que la acidez producto del ataque a glucosa, se neutraliza por la alcalinidad producida por la descarboxilación, o bien, por que el germen ha sido incapaz de utilizar la glucosa. En este último caso, el germen mostrará un TSI igualmente N/N y por lo tanto, no corresponderá a ENTEROBACTERIACEAE.

Prueba de Indol.- Se investiga después de incubar a 37˚C  por 24 horas, el indol formado en caldo peptonado o triptonado, agregando gotitas del reactivo de Kovacs, agitar por unos minutos.

La reacción es (+) si se forma un anillo constante, coloreado de rojo claro u oscuro.

Reacción (-): no se forma el anillo

Prueba del Rojo de Metilo.- después de haber incubado a 37˚C  por 72 horas, adicionar 5 gotas de una solución al 0,04% de rojo de metilo

Reacción (+): si se presenta coloración roja.

Reacción (-): aparición de color amarillo.

Prueba de Voges - Proskauer.- Se incuba el medio sembrado a 37˚C  por 72 horas, luego se adiciona 05mL. de una solución de KOH al 40%; agitar vigorosamente durante 3 minutos, observar la coloración luego de 10 minutos.

Reacción (+): si se presenta coloración rojo carmín.

Reacción (-) : no hay aparición de color.

Asimilación de Citrato.- Luego de sembrar el inóculo por estría superficial en agar inclinado, se incuba a 37˚C  por 48 horas observar la coloración.

Reacción (+): viraje del medio de cultivo del verde al azul intenso.

Reacción (-): no hay viraje.

Luego del triple número obtenido (confirmado según resultados del IMViC), se logra el valor de la Tabla del NMP, para después calcular la población de Escherichia coli, en la muestra problema de manera similar a los anteriores.

III.- MATERIALES Y EQUIPOS.

• Medio TSI, LIA e INDOL
• Reactivo de Kovacs.
• Incubadora bacteriológica.
• Medio de cultivo con colonias de microorganismos (de la práctica anterior)
• Aguja de Kolle
• Mechero

IV.- METODOLOGIA

De las placas sembradas de la práctica anterior sembrar con aguja de Kolle por punción profunda a los tubos que contienen el medio TSI y LIA, también transferir una pequeña carga microbiana al tubo que contiene el indol, esto debe ser de la misma colonia, llevar a incubar por 24 horas.

...