Practica De Fotosintesis

(PARTE B)

FOTOSÍNTESIS EN CLOROPLASTOS.

1. INTRODUCCIÓN.

La importancia del ATP en los organismos vivos ha hecho que muchos esfuerzos sean canalizados en la investigación sobre su formación. La hipótesis con que usted debe estar familiarizado 'propone que el trasporte de electrones en la cadena respiratoria resulta en un almacenamiento de energía contenido en algún compuesto intermedio" rico en energía". Este intermediario debe ser capaz de transferir su energía a ADP para formar ATP. Un compuesto intermedio similar fue propuesto en la fosforilación fotosintética, pero aún no ha sido posible aislar este compuesto químico intermediario de "alta energía".

Desde 1964, se propuso una segunda teoría que ahora encuentra suficientes evidencias disponibles para respaldada. Es llamado el "Modelo quimiosmótico" o de Mitchell, y propone lo siguiente: Durante el trasporte de electrones, iones de hidrógeno son trasportados a través de la membrana mitocondrial (en este caso tilacoidal) resultando por lo tanto un gradiente de protones. La energía que representa este gradiente puede ser utilizada por una ATPasa, para fabricar ATP (reacción reversible) a medida que los protones se filtran. Se ha sospechado que además existe un componente eléctrico.

Con respecto a la FOTOFOSFORILACION se ha demostrado que los protones son bombeados adentro del cloroplasto en la luz. Entonces si se crea un gradiente artificial a través de la membrana del cloroplasto, cambiando el pH del medio de ácido a básico, el ATP es producido en la oscuridad.

Desacopladores actúan previniendo el establecimiento de gradiente. El experimento a realizarse nos permitirá el cambio de pH en los cloroplastos y el efecto de algunos inhibidores en el trasporte de electrones.

2. OBJETIVOS.

Con esta práctica el estudiante podrá:

• Separar cloroplastos de hojas frescas de espinacas.

• Comprender el proceso de la fotosíntesis.

• Verificar, mediante el empleo del pHmetro, el modelo quimiosmótico llevado a cabo en las membranas de los cloroplastos.

3. MATERIALES.

• -Hojas frescas de espinaca

• Licuadora o mortero.

• Centrifuga clínica.

• Gasa.

• Tubos de centrífuga.

• Hielo.

• Peachímetro.

• Magneto.

• Agitador Magnético.

• Probetas.

• beakers.

• Paño negro.

4. REAACTIVOS.

• Medio de preparación:

Tris 20 mM.

KCI 40 mM.

Sucrosa 4 m.

pH 7.8.

• Medio de lavado:

KC140 mM.

MgCl2 2 mM.

Sucrosa 4 mM.

pH 7.8.

• Pyocianina.

• HCL 1.0 mM.

• NaOH 1.0 mM.

5.- METODO.

a. Preparación de cloroplastos.

Como este procedimiento toma algún tiempo, es necesario mantener la preparación en frío. Utilice el hielo proporcionado y trabaje lo más rápido posible. Cuando esta se mantiene en frío, la preparación es bastante estable.

Triture 25 gramos de hojas de espinaca frescas en 75 mI de MEDIO DE PREPARACION por 15 segundos a velocidad máxima en una licuadora. Filtre a través de una gasa previamente enfriada y vierta en 2 tubos de centrifuga. Lleve a centrifugar por 1 minuto a 200 g para remover los desechos. Utilice el sobrenadante. Centrifugue nuevamente a 2000 g por 5 minutos y guarde el precipitado.

Resuspenda (disuelva) el precipitado suavemente en 20 mI de MEDIO DE LA VADO, y centrifugue de nuevo 2 minutos a 2000 g. Repita el lavado 3 veces. Guarde los cloroplastos "lavados" en el medio de lavado y en hielo.

B.- Medidas de 12H.

Coloque en cero el pHmetro. Llene la cámara de reacción (beaker de 50 mi) con preparación de cloroplastos. Coloque una barra magnética, lleve al agitador y mantenga en un baño de agua fría. Comience a agitar y añada 0.2 mI de solución de pyocianina; cubra la cámara con un paño negro y apague la luz. Muy cuidadosamente comience a añadir HCl 1.0 mM hasta obtener un pH de 6.0 ó 6.1. No deje bajar el pH de 6.0, pues la preparación se destruiría.

Cuando el pH quede estable en este rango, prenda la luz, destape el paño y observe el cambio en el pH. De nuevo apague la luz por 5 minutos ó hasta que el pH sea constante y repita de nuevo lo anterior. Observe el cambio de pH y añada otros 0.2 mI de pyocianina. Trate de observar el cambio de pH después de cortos intervalos de oscuridad. Qué ocurre?

Qué conclusiones puede usted hacer de estas observaciones?

Reduzca la luz con un filtro de gasa. Qué efecto tiene?

Observe el efecto de inhibidores de producción de O2 en el cambio de pH?

6 . PREGUNTAS.

-Cuál es la posible localización de la bomba de protones en el cloroplasto? Cómo es su mecanismo?

-Qué significado tiene la bomba de H+ en la fotosíntesis?

-Cuáles serían los efectos de FMN y DCMU?

7. BIBLIOGRAFIA.

-LEHNINGER A L, D NELSON y M M COX. 1993 "PrincipIes of Biochemistry" Second Edition. Worth Publishes. New York.

-AVERS e J.1991. "Biología Celular" Segunda Edición. Grupo Editorial

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-KARP G. 1987. "Biología Celular" Segunda Edición. McGraw-Hill. México.

-HORTON H R, L A Moran R S Ochs, J D Rawn y K G Scrimgeour. 1995.

"Bioquímica". Primera Edición. Prentice Hall-Hispanoamericana, S.A México.

-LEHNINGER A L.1979. "Bioquímica" Segunda Edición. Editorial Omega, S.A. Barcelona.

-RA WN J D.1989. "Bioquímica" Primera edición. Interamericana- McGraw-Hill. México. p 1107.

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