Preparación de geles acrilamida para la electroforesis. SDS - PAGE
Enviado por Verónica Pardal Curiel • 6 de Junio de 2018 • Apuntes • 1.140 Palabras (5 Páginas) • 441 Visitas
CFGS LABORATORIO DE ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD MÓDULO: Ensayos Biotecnológicos | Práctica 5: Preparación de geles acrilamida para la electroforesis. SDS - PAGE | Fecha de realización: 23/04/2018 Fecha de entrega: 07/04/2018 |
Verónica Pardal Curiel 2º LACC Mañana |
- Objetivo:
Preparar los geles de acrilamida para realizar una electroforesis SDS – PAGE.
- Fundamento teórico:
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido, a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución. Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica moléculas y a su masa. Basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico la electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.
SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico): Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, biología molecular y ciencia forense para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas.
- El gel de resolución separa las muestras y debe tener mayor concentración de acrilamida y pH más básico (8,3), de manera que ofrezca mayor resistencia en la corrida a los polipéptidos.
- El gel de empaquetamiento posee baja concentración de acrilamida en tampón ligeramente acido (pH = 6,8) de forma que ofrezca poca resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa rapidez.
[pic 1]
Imagen 1. Equipo Mini-Protean de la marca BIO-RAD.
- Procedimiento:
- Preparación de disoluciones:
- Disolución de SDS 10%. Pesar 10 g de SDS, disolver y enrasar en un matraz aforado con agua destilada.
- Disolución de Persulfato de amonio al 10%. Pesar 10 g de Persulfato de amonio, disolver y enrasar en un matraz aforado con agua destilada.
- Disolución de Acrilamida al 30%. Mezcla de acrilamida (29,2 g) y bis-acrilamida (0,8g).
Pesar los dos reactivos, disolver y enrasar en un matraz aforado con agua destilada.
Filtrar en papel de filtro Whatman Nº 1.
- Preparación de gel de resolución:
- Ensamblar el cassette, según instrucciones del fabricante.
- Preparar el gel de resolución siguiendo esta tabla.
Agua destilada | 2,4 mL |
Acrilamida – bisacrilamida 30% | 5,0 mL |
Tris/HCl 1,5M pH = 8,8 | 2,5 mL |
SDS 10% | 100 µL |
Persulfato de amonio 10% | 50 µL |
TEMED | 5 µL |
El persulfato y el TEMED se deben agregar justo cuando vayamos a preparar el gel para evitar que polimerice la mezcla antes de tiempo.
- Verter la solución de acrilamida con una pipeta Pasteur en el contenedor representado por dos vidrios sujetos al cassete.
- Dejar aproximadamente 1,5 cm de distancia entre la solución de acrilamida y el final del vidrio frontal:
[pic 2]
Imagen 2. Espacio de 1,5 cm dentro del cassette
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