ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMINA

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ENZIMOLOGÍA ALIMENTARIA

D en C.SANTIAGO GALLEGOSTINTORE[pic 2]

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMINA

EQUIPO2

BARDALESECHEVERRIANELLY

GAMBOA CASTAÑEDA RIGOBERTO

CHULIM CAMARA SAUL^[a]

RESUMEN

En la presente práctica se determinara ^[b]el peso molecular del extracto de latex ^[c]y papaína comercial se empleara el método de electroforesis para la presente práctica. Para  efectuar este procedimiento se tienen que preparar previamente los geles que se utilizaran en la práctica, se prepara el aparato donde se llevara a cabo la electroforesis, y esperamos un determinado tiempo para que el gel quede solido, una vez terminado lo anterior  se procede a colocar las muestras de  papaína comercial y latex se espera dos horas y luego se tiñen. Los datos obtenidos de peso molecular de la papaína comercial y el latex  fueron:   25.33 en ambos^[d]

INTRODUCCIÓN

La electroforesis fue introducida por primera vez en 1907 por Michaelis para definir el fenómeno por el cual una molécula que posee carga neta se desplaza en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico. La velocidad de migración o movilidad a través del campo eléctrico dependerá de varios factores como son: la intensidad de dicho campo; la carga neta, tamaño y forma de las moléculas; así como la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las moléculas se están moviendo. La electroforesis es una herramienta analítica simple, rápida y muy  sensible,  lo  que  la  convierte  en  una  técnica  de  gran  utilidad  para  la separación y el estudio de moléculas cargadas tales como proteínas y ácidos nucleicos (Bambeck SG., 1996).

Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las cuales se va a llevar a cabo la separación (Bambeck SG., 1996):

•    Electroforesis capilar.

•    Electroforesis en papel.

•    Electroforesis en gel de agarosa.

•    Electroforesis en gel de poliacrilamida.

•    Isoelectroenfoque.

•    Electroforesis bidimensional.

La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida  es sin duda alguna una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. Por lo que es un método de purificación, ya que nos permite aislar un solo tipo de proteína  de una mezcla muy compleja, en efecto  la purificación de proteínas es importante para la caracterización de la función, estructura en interacciones de la proteína de interés (García, 2000).

El  principio  del  método  de  electroforesis  en  geles  de  poliacrilamida    es  la migración de  solutos iónicos  bajo  la  influencia de  un  campo eléctrico; Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo en una dependencia combinación de su carga, peso  molecular y estructura tridimensional. La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible (García, 2000).

Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pH´s, temperatura y fuerza iónica (García, 2000).

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración (García, 2000).

Esta técnica permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína, comparando su movilidad electroforética con la de proteínas de PM conocido. Estas determinaciones poseen un margen de error de 10%. Algunos tipos de proteínas pueden mostrar una  migración atípica en esta  técnica, por ej. Proteínas con puntos isoeléctricos muy extremos (donde la carga intrínseca puede ser lo suficientemente fuerte para influir en la movilidad), o proteínas altamente glicosiladas. La determinación del peso molecular de una enzima y el número de centros activos  por moléculas, nos permite calcular el número de recambio del enzima dicho de otro modo el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por la unidad de tiempo (García, 2000).

En el método de electroforesis para expresar el peso molecular  de una proteína se utilizan las unidades en Kilodaltons (equivale a 1000Daltons) y puede ser determinado comparando la banda con un patrón  de proteínas estándar de peso conocido denominado marcador de peso molecular (Bambeck SG., 1996^[e]).

El peso molecular de la papaína es de 33 KDa,^[f] la papaína bruta, contiene un poco de agua, glúcidos, ácidos orgánicos y una mezcla de enzimas, donde destacan las denominadas proteasas que actúan rompiendo los enlaces peptídicos en cualquier lugar de la cadena peptídica en la que se hallen situados (endopeptidasas). dentro de estas enzimas proteolíticas, la que se encuentra en mayor cantidad es la papaína, de la que se distinguen la papaína i o papaína propiamente dicha y la papaína ii o quimopapaina, que es más estable en medio ácido, pero su actividad proteolítica es cuantitativamente menos marcada que la de la anterior, pues sólo coagula la leche. Además también contiene pequeñas cantidades de otros enzimas: papaya peptidasa a, lipasa y lisozima (enzima que rompe las paredes de las células bacterianas). La papaína pura, es una proteína constituida por 212 aa, que se encuentran enrollados en dos partes separadas por un puente que tiene un lugar activo con un grupo tiol libre. La papaína es una enzima de baja especificidad que hidroliza tanto las proteínas como los péptidos de pequeño tamaño, amidas y ésteres. Preferentemente actúa sobre los aa básicos, leucina, glicina, así como sobre arginina, lisina y fenilalanina (son en enlacen próximos al grupo carboxilo de la fenilalanina). Es activada por la cisteína (aa), el tiosulfato (compuesto de azufre) y el glutatión. Es inhibida o inactivada por iones metálicos (zinc, cadmio, hierro, plomo), oxidantes (h2o2, radicales libres, etc.) y por agentes que reaccionan con los tioles (ácido ascórbico).(Jansen, 1941).

En el campo de la investigación científica; Muchos científicos   utilizan la a electroforesis en el área de genética forense  como principal objetivo  la detección de ADN ya que permite la estimación robusta de la cantidad de ADN y su calidad ya que la calidad es estimado por observación de la ausencia de rayas o fragmentos (Yábar C., 2003).

De igual manera utilizan los científicos  la electroforesis  para el cáncer humano, ya que  se asocia con la forma de vida, antecedentes infecciosos, exposición a radiaciones, por lo que las investigaciones instrumentan acciones preventivas en la búsqueda ^[g]de tratamientos de origen natural como el uso de plantas. Es así que el objetivo de esta investigación es evaluar la actividad antigenotóxica  utilizando el ensayo de Electroforesis Unicelular (ensayo cometa), método que evalúa el daño al ADN celular y es útil para estudios de genotoxicidad y antigenotoxicidad (Yábar C., 2003).

Para llevar a cabo este método analítico se tienen que tener en cuenta diferentes medidas de seguridad; entre las cuales se puede mencionar  que  para preparar y manipular  los  geles  deben  de  utilizarse  guantes  ya  que  la  acrilamida  es neurotóxica altera al sistema nervioso (Bambeck SG., 1996).

OBJETIVO:

Determinar el peso molecular de la papaína comercial y de latex a partir  por el método de electrforesis

Metodología:

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