Purificación de PCR
Enviado por biotech98 • 11 de Mayo de 2020 • Prácticas o problemas • 701 Palabras (3 Páginas) • 49 Visitas
Practica No. 4. Electroforesis y purificación de prod. PCR
BIOLOGIA MOLECULAR: Dra. Blanca Estela Barrera
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Ingeniería en biotecnología. 5to semestre
Observaciones
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Introducción
La electroforesis es una técnica analítica por el cual se separan moléculas por tamaño o peso molecular usando una corriente eléctrica. La PCR se basa en el uso de la capacidad de la ADN polimerasa para sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de plantilla ofrecida. Debido a que la ADN polimerasa puede agregar un nucleótido solo a un grupo 3'-OH preexistente, necesita un cebador al que pueda agregar el primer nucleótido. Este requisito hace posible delinear una región específica de secuencia de plantilla que el investigador quiere amplificar. Al final de la reacción de PCR, la secuencia específica se acumulará en miles de millones de copias (amplicones).
Consumibles, materiales y equipos:
- Se requiere todo lo especificado en la SESIÓN 1.3.
- Navaja de bisturí
- 5 microtubos de 1.5 mL
- Agua desionizada estéril
- Etanol absoluto
- Solución de acetato de sodio 3M
Procedimiento
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Cuestionario:
- ¿Se obtuvo el producto en el tamaño esperado?
Suponemos que si(solo fue un representante)
- ¿Cuál fue el rendimiento de producto total después de la purificación? ————
- Calcule en número de moléculas presentes por unidad de volumen en el purificado. Considere la concentración del producto (medición en nanodrop) y el peso molecular del amplicón.————
- Investigue y describa los requerimientos para la secuenciación del ADN mediante un proveedor de servicios externo.
- DNA PURO
- DNA NO DESNATURALIZADO
- ¿Qué método se empleará para la secuenciación del producto?
Suponemos que la secuenciación de Sanger
- ¿Cuál es su fundamento?
se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. El método de secuenciación ideado por Sanger se basa en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. Esto sucede porque la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo. El método comienza una vez que se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador (denominado “primer” en inglés), que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la ADN polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.
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