RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE LABORATORIO, NORMAS DE SEGURIDAD DE TRABAJO EN EL LABORATORIO, TECNICAS Y METODOLOGIA DE INVESTIGACION UTILIZADOS EN BIOLOGIA - MICROSCOPIA

BIOLOGIA

LABORATORIO DE BIOLOGIA Nro. 1

TRABAJO GRUPAL

SONIA JULIETH VERGARA GARCIA

C.C. 1.110.534.059

SONIA MILENA OSPINA SANCHEZ

C.C. 1.110.531.451

LUIS ALBERTO MOLANO

C.C. .93.371.535

EDWIN ANDRES OSMA PINZON

C. C. 80.863.672

EDUAR GALINDO HOMEZ

C.C. 93.381.214

TUTOR: JORGE ARLEX VELASQUEZ BELTRAN

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS SOCIALES ARTES Y HUMANIDADES

PROGRAMA PSICOLOGÍA

CURSO 20101 GRUPO 3

SEPTIEMBRE 8 DE 2.011

CEAD IBAGUÉ TOLIMA

RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE LABORATORIO, NORMAS DE SEGURIDAD DE TRABAJO EN EL LABORATORIO, TECNICAS Y METODOLOGIA DE INVESTIGACION UTILIZADOS EN BIOLOGIA – MICROSCOPIA

1. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1.1 BIOSEGURIDAD

Es la aplicación de conocimientos, conjunto de normas o actitudes a personas, laboratorios, áreas hospitalarias y medio ambiente, que tienen como objetivo prevenir la exposición a agentes potencialmente infecciosos o considerados de riesgo biológico. Tratando de evitar al máximo accidentes en el área de trabajo para disminuir el potencial riesgo ocupacional.

Este a su vez define condiciones de contención bajos las cuales los agentes infecciosos deben ser manipulados con el objetivo de confinar el riesgo biológico y reducir la exposición potencial de personas, áreas, pacientes, público y medio ambiente. Es de aclarar que los riesgos pueden estar relacionados con las propias instalaciones, con las muestras de origen biológico, con los procedimientos y manipulaciones que se realicen.

LOS PRINCIPIOS DE LA BIOSEGURIDAD PUEDEN RESUMIRSE EN:

Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los estudiantes, trabajadores y profesionales de todos los servicios, independientemente de conocer o no su serología. Todo el personal debe seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones, deben ser aplicadas para todas las personas, independientemente de presentar o no patologías.

Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las probabilidades de una infección

TIPO DE EXPOSICION ENFERMEDAD

Exposición al VIH Infección por VIH - SIDA

Exposición al Virus de la Hepatitis B Hepatitis B

Exposición al Virus de la Hepatitis C Hepatitis C

Exposición al Clostridium Tétanos Tétanos

Exposición a la Brucelas Brucelosis

Exposición a enfermedades trasmitidas por animales. Rabia humana, Mordedura de Serpiente, Picadura de Alacranes.

Exposición a enfermedades transmitidas por gotas, aerosoles, por contacto. Tuberculosis, Varicela, Sarampión.

Exposición a enfermedades transmitidas por vectores Dengue, Leishmaniosis.

Control de enfermedades infecciosas por aguas y alimentos contaminados Fiebre tifoidea, Hepatitis A.

Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en la atención de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo.

1.2 NORMAS BASICAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA

Antes de adentrarnos en las principales normas a tener en cuenta para el desarrollo de prácticas en el laboratorio de Biología:

NORMAS DE PROTECCIÓN PARA EL LABORATORIO

 Cada laboratorio en función de sus riesgos, debe tener instrucciones particulares en caso de incendio.

 Se debe conocer la localización y el funcionamiento de los equipos extintores cuyo mantenimiento periódico asegura su perfecto estado.

 Se debe conocer la señalización de emergencia para evitar que se produzcan equívocos o indecisiones en caso de accidente o fuego.

 Debe existir un botiquín de primeros auxilios y el profesor responsable conoce las pautas a seguir para solicitar ayuda externa (teléfonos de urgencia, etc...).

 Es necesario conocer el funcionamiento y situación de las duchas de emergencia y lavaojos.

 Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes. Los guantes deben ser desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se debe salir de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se debe coger el teléfono.

 marque y rotule adecuadamente las láminas. Deben llevar claramente escrito en un lugar visible, el nombre o identificación del grupo de trabajo, practica realizada y fecha.

 es importante conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.

 es necesario conocer el manejo de cada uno de los equipos existentes en el laboratorio. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado con el fin de evitar roturas.

 en neveras que no posean un sistema de protección anti deflagración no deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables como éter etílico.

 los productos inflamables como gases, alcohol, éter, entre otros deben mantenerse alejados de la llama del mechero. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.

NORMAS PARA EL INGRESO AL LABORATORIO

 las batas de laboratorio deberán tener los puños ajustados a la muñeca, siendo conveniente que sean cerradas en la parte delantera y cuello.

 Para manejo de productos en polvo con marcada acción biológica, se utilizarán batas sin bolsillos, ya que éstos pueden servir como depósito de suciedad y polvo.

 En los trabajos de riesgo, se tendrá en cuenta la composición del tejido con el que están fabricadas.

 Se debe evitar que el lavado de esta ropa de trabajo se realice junto con la ropa de calle.

 Se recomienda disponer siempre de gafas de seguridad que deberán ser de uso individual.

 Se utilizarán los guantes adecuados en función de la tarea que se vaya a desarrollar.

 La ropa de calle no es aconsejable mantenerla en el laboratorio, por lo que deberá disponerse de taquillas o armarios fuera de la zona de trabajo.

NORMAS EN EL LABORATORIO

 Está prohibido comer, beber, masticar chicle, almacenar alimentos, fumar, aplicarse cosméticos y manipular lentes de contacto (estas están permitidas solamente cuando no sea posible usar otro tipo de lentes de contacto).

 Siempre deben usar bata de manga larga, completamente abrochada.

 El pelo largo debe llevarse recogido y las uñas cortas y limpias.

 El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio. En las superficies de trabajo debe minimizarse el material que no sea pertinente al mismo. No colocar sus pertenencias (bolsas, mochilas, etc.) sobre las mesas de trabajo.

 Deben lavarse las manos al inicio y al final del trabajo en el laboratorio, y cada vez que se sospeche contacto con material contaminado.

 Está terminantemente prohibido pipetear con la boca.

 En caso necesario, deben usar guantes. Usar protectores de cara, lentes de seguridad y/o mascarillas para proteger la cara o los ojos de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV u otras radiaciones.

 Deben trabajar de manera tal de minimizar la creación de aerosoles. Evitar agitaciones y pipeteos bruscos, así como la introducción de asas de cultivo calientes dentro de medios de cultivo.

 Los punzocortantes y el material contaminado deberán colocarse en los recipientes que para el efecto se proporcionan.

 Al finalizar la tarea, deben limpiar y descontaminar las superficies de trabajo. En caso de haber derramado material contaminado, deberán proceder inmediatamente a descontaminar el área afectada.

 Todos los accidentes o derrames de material que ocurran durante la práctica, deben ser comunicados al docente que la imparte.

 Está prohibido el uso de prendas de laboratorio en: biblioteca, comedores, aulas puras, salas de reuniones, oficinas administrativas y otras áreas comunes ajenas al laboratorio.

 No se guardarán alimentos o bebidas en los frigoríficos de los laboratorios.

 No se olerá ningún producto químico para intentar su identificación ya que puede ser nocivo o tóxico.

 Se evitará el uso de pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran introducirse o engancharse en los objetos o montajes de trabajo.

NORMAS PARA APLICAR UNA VEZ CONCLUIDO EL LABORATORIO

 Las manos deben lavarse:

 Después de cualquier operación que implique el contacto con material irritante, tóxico, cáustico o infeccioso.

 Siempre que se quiten guantes protectores.

 Antes de abandonar el laboratorio.

 Para el secado de las manos es preferible la utilización de papel desechable o secadores de aire en lugar de toallas.

 La última persona que abandone el laboratorio al final de la jornada, debe comprobar que los aparatos se encuentren apagados o controlados, las conducciones de gas, vacío y agua cerradas y la iluminación desconectada para evitar riesgos de incendio.

 Una vez concluida la práctica, proceda a organizar el sitio de trabajo, desinfectando el mesón con toallas de papel humedecidas con hipoclorito de sodio o alcohol y dejando tanto el material como el equipo utilizado limpio y en el lugar adecuado.

 Se debe lavar muy bien la cristalería que se utilice. Preste atención y cuidado al manipular cristalería mojada.

 En el laboratorio habrá un recipiente plástico, para cristalería rota y para plásticos que hayan estado en contacto con cultivos de células o virus. Por favor, deseche cada cosa en el envase apropiado.

1.3 COMO SE EVITAN EN EL LABORATORIO DAÑOS PARA LA SALUD

Mediante el conocimiento y la aplicación adecuada de las normas de bioseguridad, como la utilización de bata, guantes, tapabocas, entre otros; Es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se esté desenvolviendo conocer y tomar con importancia las normas antes, durante y después de cada práctica. Recordemos el significado de las siguientes palabras:

ACCIDENTE: Suceso eventual o acción de que involuntariamente resulta daño para las personas o las cosas.

DESINFECTANTE: Sustancia que destruye los gérmenes o microorganismos presentes, a excepción de las esporas bacterianas

PRECAUCION: Reserva, cautela para evitar o prevenir los inconvenientes, dificultades o daños que pueden temerse.

INVESTIGACION: La que tiene por fin ampliar el conocimiento científico, sin perseguir, en

Principio, ninguna aplicación práctica.

Desde el siglo XIX, después de la construcción del primer laboratorio; se encontró que todos los trabajadores estaban expuestos a una serie de riesgos que atentaban contra su integridad. Por este motivo es que los laboratorios han sido construidos y modificados para que los riesgos sean mínimos (campanas extractoras de gases, alarma para gas, extintores, lavaojos o duchas, entre otros), se deben tener siempre en cuenta una serie de precauciones y seguir unas normas de seguridad básicas las cuales están destinadas a mantener el control de los factores de riesgo, tanto químicos, físicos, orgánicos, psicológicos, ambientales, biológicos, ergonómicos y de seguridad, los cuales atentan contra la salud de las personas que trabajan en el laboratorio.

Muchos de los accidentes que ocurren en un laboratorio, son ocasionados principalmente por dos razones:

La falta de conocimiento acerca de la labor que se realiza dentro de él y a la negligencia para seguir las normas mínimas de seguridad.

La aplicación de las normas de bioseguridad, es importante para obtener unos resultados óptimos durante cada práctica y no presentar accidentes inesperados en los procesos analíticos, relacionados con el uso de los materiales adecuados y de la forma adecuada.

Cualquier tipo de contaminación de las muestras y del personal por la ingesta de alimentos dentro del laboratorio es uno de los factores que menos se toma en cuenta por parte de nosotros.

Otro de los casos más frecuente es el trasporte y manejo inadecuado del material, que generan más de un 70 % de los accidentes, y no permiten continuar con las practicas programadas.

1.4 DESECHOS QUE SE GENERAN EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

En el laboratorio se manejan gran cantidad de productos y se efectúan diversas operaciones que conllevan la generación de residuos, en la mayoría de los casos peligrosos para la salud y el medio ambiente. Aunque el volumen de residuos que se generan en los laboratorios es generalmente pequeño en relación al proveniente del sector industrial, no por ello debe minusvalorarse el problema.

Unas adecuadas condiciones de trabajo en el laboratorio implican inevitablemente el control, tratamiento y eliminación de los residuos generados en el mismo, por lo que su gestión es un aspecto imprescindible en la organización de todo laboratorio.

Otra cuestión a considerar es la de los derrames, que si bien tienen algunos aspectos coincidentes con los métodos de tratamiento para la eliminación de residuos, la actuación frente a ellos exige la consideración de otros factores como la rapidez de acción, aplicación de métodos de descontaminación adecuados, etc.

Para una correcta realización de lo indicado anteriormente es aconsejable designar personas responsables, así como facilitar una completa información a todo el personal del laboratorio sobre estos temas.

Clasificación de los residuos

El tipo de tratamiento y gestión de los residuos del laboratorio depende, entre otros factores, de las características y peligrosidad de los mismos, así como de la posibilidad de recuperación, de reutilización o de reciclado, que para ciertos productos resulta muy aconsejable.

Si consideramos su peligrosidad se podría establecer la siguiente clasificación.

Residuos no peligrosos

Estos residuos, considerando sus propiedades, pueden eliminarse mediante vertidos, directamente a las aguas residuales o a un vertedero. Si aun no considerándose peligrosos, son combustibles, se pueden utilizar como combustibles suplementarios, como ocurre, por ejemplo, con los aceites, que, si son "limpios", se pueden eliminar mezclándolos con combustibles; los aceites fuertemente contaminados, en cambio, deberán ser procesados en función de los contaminantes que contengan (metales, clorados, etc.).

Residuos químicos peligrosos

Combustibles

Pueden utilizarse como combustible suplementario o incinerarse. Debe controlarse la posible peligrosidad de los productos de combustión.

No combustibles

Pueden verterse a las aguas residuales o vertederos controlados siempre que previamente se haya reducido su peligrosidad mediante tratamientos adecuados.

Explosivos

Son residuos con alto riesgo y normalmente deben ser manipulados fuera del laboratorio por personal especializado.

Gases

Su eliminación está en función de sus características de peligrosidad (tóxica, irritante, inflamable). Para su eliminación, deberán tenerse en cuenta las normativas sobre emisión existentes.

Residuos biológicos

Deben almacenarse en recipientes específicos convenientemente señalizados y retirarse siguiendo procesos preestablecidos. Normalmente se esterilizan y se incineran.

Residuos radiactivos

Para su eliminación deben considerarse sus características físico-químicas así como su actividad radiactiva y vida media (tiempo de semidesintegración). Su almacenamiento debe efectuarse en recipientes específicos debidamente señalizados y deben retirarse de acuerdo a los procedimientos establecidos. Su gestión es competencia del Consejo de Seguridad Nuclear (CSN).

1.5 MODO ADECUADO DE DESCARTAR LOS DESECHOS

Los residuos generados en el laboratorio pueden tener características muy diferentes y producirse en cantidades variables, aspectos que inciden directamente en la elección del procedimiento para su eliminación.

• Volumen de residuos generados.

• Periodicidad de generación.

• Facilidad de neutralización.

• Posibilidad de recuperación, reciclado o reutilización.

• Coste del tratamiento y de otras alternativas.

• Valoración del tiempo disponible.

Todos estos factores combinados deberán ser convenientemente valorados con el objeto de optar por un modelo de gestión de residuos adecuado y concreto. Así por ejemplo, si se opta por elegir una empresa especializada en eliminación de residuos, se debe concertar de antemano la periodicidad de la recogida y conocer los procesos empleados por la empresa, así como su solvencia técnica. La elección de una empresa especializada es recomendable en aquellos casos en que los residuos son de elevada peligrosidad y no les son aplicables los tratamientos generales habitualmente utilizados en el laboratorio.

Procedimientos para eliminación-recuperación de residuos

Los procedimientos para la eliminación de los residuos son varios y el que se apliquen unos u otros dependerá de los factores citados anteriormente, siendo generalmente los más utilizados, los siguientes:

Vertido

Recomendable para residuos no peligrosos y para peligrosos, una vez reducida ésta mediante neutralización o tratamiento adecuado. El vertido se puede realizar directamente a las aguas residuales o bien a un vertedero. Los vertederos deben estar preparados convenientemente para prevenir contaminaciones en la zona y preservar el medio ambiente.

Incineración

Los residuos son quemados en un horno y reducidos a cenizas. Es un método muy utilizado para eliminar residuos de tipo orgánico y material biológico. Debe controlarse la temperatura y la posible toxicidad de los humos producidos. La instalación de un incinerador sólo está justificada por un volumen importante de residuos a incinerar o por una especial peligrosidad de los mismos. En ciertos casos se pueden emplear las propias calderas disponibles en los edificios.

Recuperación

Este procedimiento consiste en efectuar un tratamiento al residuo que permita recuperar algún o algunos elementos o sus compuestos que su elevado valor o toxicidad hace aconsejable no eliminar. Es un procedimiento especialmente indicado para los metales pesados y sus compuestos.

Reutilización - Reciclado

Una vez recuperado un compuesto, la solución ideal es su reutilización o reciclado, ya que la acumulación de productos químicos sin uso previsible en el laboratorio no es recomendable. El mercurio es un ejemplo claro en este sentido. En algunos casos, el reciclado puede tener lugar fuera del laboratorio, ya que el producto recuperado

1.6 RIESGO BIOLOGICO

Por riesgo biológico se entiende la exposición a agentes vivos capaces de originar cualquier tipo de infección, aunque también pueden provocar alergia o toxicidad.

Las infecciones son enfermedades transmisibles originadas por la penetración en el organismo de microbios o gérmenes (virus, bacterias, parásitos, hongos). Aunque, en general, el riesgo biológico suele tener menor entidad que otros riesgos laborales (químicos, físicos, psíquicos o ergonómicos), afecta de forma muy especial a colectivos como agricultores y ganaderos o personal sanitario y de laboratorios. El crecimiento del sector terciario y, más concretamente, los servicios de atención al público (educación, servicios sociales, Administración pública) multiplican los contactos interpersonales y aumentan el riesgo de transmisión de enfermedades.

Los trabajadores y trabajadoras de compañías aéreas y del comercio internacional están expuestos a contraer enfermedades tropicales como el paludismo. El hacinamiento y la falta de higiene y limpieza adecuada en locales de trabajo favorecen, también, la aparición de enfermedades infecciosas. Es conocido, en fin, el riesgo de tétanos en todos aquellos trabajos que entrañan la posibilidad de contaminación de heridas.

La aparición de nuevas enfermedades de extrema gravedad e incidencia creciente, como el SIDA o la enfermedad de las vacas locas (EEB), suponen situaciones de riesgo nuevas y de consecuencias desconocidas o insuficientemente conocidas dentro del ambiente laboral, y que son fuente de inquietud en amplios grupos de trabajadores.

El riesgo biológico o biorriesgo consiste en la presencia de un organismo, o la sustancia derivada de un organismo, que plantea, sobre todo, una amenaza a la salud humana. Esto puede incluir los residuos sanitarios, muestras de un microorganismo, virus o toxina de una fuente biológica que puede resultar patógena. Puede también incluir las sustancias dañinas a los animales. El término y su símbolo asociado se utilizan generalmente como advertencia, de modo que esas personas potencialmente expuestas a las sustancias lo sepan para tomar precauciones.

1.6.1 BARRERA PROTECTORA

Son un medio eficaz para evitar o disminuir el riesgo de contacto con fluidos o materiales potencialmente infectados, es colocar una “barrera” física, mecánica o química entre personas o entre personas y objetos.

Estas medidas son implementadas para evitar el contacto con las salpicaduras de productos biológicos de origen contaminados, ya que suponen un riesgo de contagio cuando contactan con el tejido cutáneo o bien con la mucosa conjuntival que presente solución de continuidad o procesos inflamatorios que faciliten la penetración de posibles agentes microbianos a la dermis. El CDC y la ADA recomiendan emplear, sistemáticamente diversas barreras biomecánicas como métodos de prevención. Estas barreras han ido implementándose cada vez más en la conducta de los trabajadores de la salud bucal(8) a través de diversas técnicas que comprenden la protección de los ojos, las manos, la boca y la nariz (2), por medio del uso de guantes, tapaboca y máscara entre otros.(8)

Las barreras protectoras pueden clasificarse en: (2, 3, 4,8)

• Vestimenta protectora: calzado, bata y gorro.

• Tapa boca

• Guantes

• Protección ocular

• Lentes

• Mascarillas

1. Vestimenta Protectora:

Son todas las medidas que sirven de protección al cuerpo del trabajador de la salud.

1.1.-Calzado:

El calzado a utilizarse dentro del ambiente odontológico y por parte de los TSB, debe ser: cómodo, cerrado y de corte alto, no debe tener ninguna parte del pie expuesta al medio ambiente, y además debe ser un calzado de uso único, es decir, usado solo para estar dentro de las instalaciones del lugar del trabajo. (9)

1.2.-Bata:

Tiene por finalidad evitar la contaminación de la ropa diaria durante la atención odontológica. (10)

La bata ideal es una de material impermeable (5) o algodón poliéster (11), de manga larga, con puños elásticos, cuello redondeado y de corte alto, sin bolsillos, ni pliegues ni dobleces que permitan la retención de material contaminado y debe abarcar hasta el tercio medio de la pierna. (5, 9) Las batas deben ser cambiadas diariamente o cuando se vea sucia o contaminada por fluidos, esta no debe utilizarse fuera del ambiente de trabajo. (9,11)

1.3.-Gorro:

Tiene como objetivo proteger la cabeza del operador y su personal auxiliar, ya que existe clara evidencia de la contaminación del cabello y el cuero cabelludo con el aerosol o microgotas de saliva producido durante la práctica dental (12,13), además de evitar la caída de algún cabello en la boca del paciente durante la práctica dental.(12)

2. Tapa Boca:

Su objetivo es proteger principalmente la mucosa nasal y bucal del operador y personal auxiliar, impidiendo la penetración en el aparato respiratorio o digestivo de los detritus, aerosoles y salpicaduras que se producen en el curso de los tratamientos dentales. (5, 6, 8, 10, 11, 14,15)

El tapa boca protege de la posible inhalación de las microgotas de agua que están en el ambiente del consultorio producto de la formación de aerosoles al ponerse en contacto el agua de los instrumentos rotatorios con la saliva del paciente, tomando en cuenta que la saliva es un medio contaminado, o por la inhalación de microgotas de sangre que se pueden producir en algunos procedimientos clínicos.

Los tapa bocas se consideran eficaces cuando impiden la filtración del 95% de partículas que midan de 3 3,2 um. Otro factor que interviene en la eficacia es el tiempo medio de uso, que se estima entre 30 y 60 minutos. (8, 9, 10)

3. Guantes:

Tienen como finalidad prevenir la transmisión de las infecciones cruzadas en las manos del operador, siendo una de las barreras mecánicas más eficaces. La normativa presentada por el CDC recomienda el empleo de guantes para cada paciente, cuando se manipulasen sangre, líquidos corporales, mucosas y lesiones bucales. El uso de cada par no debe exceder un tiempo de 45 minutos, ya que estos pueden presentar desgaste o microporos. (2, 3, 5, 6, 8, 12, 14, 15, 16)

Más que un estado de esterilidad quirúrgica, lo que se pretende al llevar guantes es una protección recíproca entre el personal y el paciente (2, 6, 8, 12, 15), pues se ha comprobado que cuando se trabaja directamente sobre saliva, sangre y mucosas sin la adecuada protección que brindan los guantes, los microorganismos presentes en tales medios pueden subsistir durante días, e incluso semanas en dedos y uñas. (8)

4. Protección Ocular:

Tiene como finalidad prevenir infecciones o traumas a nivel ocular a través de salpicaduras, aerosoles o microgotas flotantes en el ambiente generadas durante la consulta odontológica. (5, 10, 15, 17, 18) Los ojos por su limitada vascularidad y baja capacidad inmunitaria son susceptibles a lesiones micro y macroscópicas. (12)

Los lentes protectores son insuficientes como barrera protectora, pues no cubren por completo la cara del operador y de esta manera dejan al descubierto parte de la piel. Esto ha llevado a la necesidad de utilizar un mecanismo de protección más seguro, que es la máscara, la cual debe sobrepasar por lo menos 8 cm. por debajo del mentón. (12)

El empleo de la máscara no exime el uso de tapa boca para la protección de aerosoles contaminados. (11)

1.6.2 AGENTE INFECCIOSO

Microorganismo (virus, bacteria, hongo, rickettsia, protozoario o helminto) capaz de producir una infección o enfermedad infecciosa. Hay factores que aumentan su capacidad para causar enfermedad y varían entre las categorías de los agentes, incluyendo: la especificidad del huésped, la capacidad de reproducción o sobrevivencia fuera del huésped y su virulencia (capacidad de causar enfermedad grave o muerte).

Los virus son agentes infecciosos de tamaño muy pequeño (no pueden ser observados al microscopio óptico, aunque sí al microscopio electrónico). Su estructura es muy sencilla y necesitan invadir un huésped para multiplicarse. Están formados por una cubierta proteica y un material genético en su interior. En cambio.

Las bacterias son organismos formados por una sola célula, pero con una estructura más compleja que les permite dividirse por sí mismas. Estas características estructurales peculiares son fundamentales a la hora de luchar contra las infecciones producidas por estos microorganismos.

1.6.3 NIVELES DE BIOSEGURIDAD

Los niveles de bioseguridad son estándares internacionales y su clasificación está dada en función del grado de letalidad de las enfermedades.

Tabla de Niveles de Bioseguridad. (BSL: Biological safety Levels)

BSL

Tabla de Niveles de Bioseguridad Agentes Infecciosos Prácticas Equipamiento de seguridad. (Barreras Primarias) Infraestructura.

( Barreras

Secundarias)

Nivel 1 No causales de enfermedad en adultos sanos Trabajos microbiológicos estándares No se requieren Mesadas con bachas y agua corriente

Nivel 2 Asociados con enfermedades en adultos, peligro de infección por: herida percutánea, ingestión, exposición de membranas mucosas BSL-1 más: Acceso limitado, Señalización de peligro biológico, Manual de bioseguridad disponible, descontaminación rutinaria de desechos seleccionados Gabinetes de seguridad Clase I o II para todas las manipulaciones de agentes que puedan causar aerosoles o derrames. Guardapolvos, guantes y mascarillas cuando se requieran BSL-1 más: autoclave dedicada

Nivel 3 Exóticos con potencial de transmisión por aerosoles, causales de enfermedades serias o letales BSL-2 más: Acceso controlado, Descontaminación de todos los desechos, Descontaminación de ropa de trabajo, Controles serológicos periódicos

BSL-2 para todas las manipulaciones, respiradores autónomos cuando se requieran BSL-2 más: Separación física de pasillos y laboratorios, Puertas de acceso doble con cerradura automática, Aire viciado no recirculado, Flujo de presión negativa en el laboratorio

Nivel 4 Exóticos peligrosos con alto riesgo de enfermedad letal, infecciones transmisibles por aire y por vías desconocidas BSL-3 más: Cambio de ropa antes de entrar al recinto, Ducha descontaminante al salir del mismo, todos los materiales descontaminados para salir del ámbito Todos los procedimientos llevados a cabo en gabinetes Clase III, o gabinetes Clase I y II en combinación con traje completo de presión positiva BSL-3 más: Edificio aislado o zona caliente. Sistema de circulación de aire, vacío y descontaminación dedicados.

1.7 PROCEDIMIENTOS A SEGUIR ANTE DERRAME DE MATERIAL BIOLÓGICO CONTAMINADO

Cuando se produzca derrame de material infectado o potencialmente infectado, el operador deberá ponerse guantes y luego cubrir el fluido derramado con el papel absorbente, derramar alrededor de este material, solución descontaminante y finalmente verter solución descontaminante sobre el papel y dejar actuar por lo menos 20 minutos. Usando materia absorbente, seco y limpio, levantar el material y arrojarlo al recipiente de desechos contaminados para su posterior eliminación.

La superficie deberá ser enjuagada nuevamente con solución descontaminante. Los guantes serán descartados después del procedimiento. No se recomienda el uso del alcohol ya que evapora rápidamente y además coagula los residuos orgánicos superficiales sin penetrar en ellos.

Manejo y eliminación del material contaminado y desechos.

1. Todo el equipo reusable (por ej. puntas de micro pipetas, jeringas, cánulas, agujas, tubos para recolección de especímenes, etc.) deberá ser ubicado en un recipiente metálico o de plástico resistente a punciones o cortaduras. Se recomienda el uso de bidones y botellas de plástico o cualquier recipiente similar acondicionado para tal fin. El recipiente contendrá líquido descontaminante (ver Anexo 2, pág. 21) y deberá estar ubicado en el mismo lugar de trabajo.

2. Los camisolines, chaquetas y otra prenda protectora que se use en el laboratorio, deberá ser colocada, al finalizar la tarea, dentro de un recipiente a prueba de pérdidas en el que será transportado de manera segura al lugar adecuado para proceder a la descontaminación y posterior preparación de las prendas para su reusó.

3. Todo elemento descartable (ej. agujas, jeringas, etc.) deberá ser colocado en un recipiente de material resistente a punciones y/o cortaduras, similar al descripto en 1), el que será colocado dentro de un recipiente a prueba de pérdidas para ser descontaminado e incinerado siempre que esto sea posible.

4. Para la eliminación de todo material contaminado, el método de lección es la incineración de los mismos si el incinerador está ubicado en el predio del laboratorio y bajo el control del mismo. En caso contrario este material será auto clavado y luego destruido.

1.8 TABLA PRINCIPALES SÍMBOLOS DE PELIGROSIDAD DE LAS SUSTANCIAS QUÍMICAS FRASES R FRASES S

Clasificación de peligrosidad

Explosivos: Sustancias y preparados que puedan explosionar bajo el efecto de una llama o que son más sensibles a los choques o a la fricción que el dinitrobenceno.

Comburentes: Sustancias y preparados que, en contacto con otros, particularmente con los inflamables, originan una reacción fuertemente exotérmica.

Extremadamente inflamables: Sustancias y preparados líquidos cuyo punto de destello sea inferior a 0º C, y su punto de ebullición inferior o igual a 35º C.

Fácilmente inflamables: Se definen como tales:

• Sustancias y preparados que, a la temperatura ambiente en el aire y sin aporte de energía, puedan calentarse e incluso inflamarse.

• Sustancias y preparados en estado líquido que tengan un punto de destello igual o superior a 0º C e inferior a 21º C.

• Sustancias y preparados sólidos que pueden inflamarse fácilmente por la acción breve de una fuente de ignición y que continúen quemándose o consumiéndose después del alejamiento de la misma.

• Sustancias y preparados gaseosos que sean inflamables en el aire a presión normal.

• Sustancias y preparados que en contacto con el agua o el aire húmedo desprendan gases fácilmente inflamables en cantidades peligrosas.

Inflamables: Sustancias y preparados cuyo punto de destello sea igual o superior a 21º C e inferior a 55º C.

Muy tóxicos: Sustancias y preparados que, por inhalación, ingestión o penetración cutánea, puedan entrañar riesgos extremadamente graves, agudos o crónicos e incluso la muerte. Su criterio de clasificación se establece en la tabla

Tabla I: Criterios de toxicidad

Tóxicos: Sustancias y preparados que, por inhalación, ingestión o penetración cutánea pueden entrañar riesgos graves, agudos o crónicos e incluso la muerte. Su criterio de clasificación se establece en la tabla 1.

Nocivos: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea pueden entrañar riesgos de gravedad limitada.

Corrosivos: Sustancias y preparados que en contacto con los tejidos vivos puedan ejercer sobre ellos una acción destructiva.

Irritantes: Sustancias y preparados no corrosivos, que por contacto inmediato, prolongado o repetido con la piel o mucosas puedan provocar una reacción inflamatoria.

Peligrosos para el medio ambiente: Sustancias y preparados cuya utilización presente o pueda presentar riesgos inmediatos o diferidos para el medio ambiente.

Carcinogénicos: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan producir cáncer o aumento de su frecuencia.

Teratógenos: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan inducir lesiones en el feto durante su desarrollo intrauterino.

Mutagénicos: Sustancias y preparados que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan producir alteraciones en el material genético de las células.

Normas de etiquetado

En el capítulo V del Real Decreto se exponen una serie de normas para el etiquetado de las sustancias, las más importantes de las cuales se indican a continuación:

Los envases estarán etiquetados en forma clara, legible o indeleble en la lengua española oficial del Estado.

• El tamaño de la etiqueta debe corresponder como mínimo a las dimensiones descritas en la Tabla II, y deberá estar colocada de forma visible y nunca en cierres, precintos y otras partes que normalmente se utilicen al abrir el envase.

Tabla II: Tamaño de las etiquetas

• Las etiquetas deberán poderse leer horizontalmente cuando el envase esté colocado en posición normal.

• Las indicaciones como "no tóxico", "no nocivo" o cualquier otra análoga no podrán figurar en la etiqueta o sobre el envase de las sustancias comprendidas en el reglamento.

El texto de la etiqueta debe incluir:

• Nombre de la sustancia de acuerdo con el listado del citado Real Decreto, o bien, si la sustancia no estuviera incluida, debe utilizarse preferiblemente la nomenclatura de la IUPAC.

• Nombre común, en su caso.

• Concentración de la sustancia, en su caso.

• Nombre y dirección de la persona natural o jurídica que fabrique, envase, comercialice o importe la sustancia peligrosa.

• Pictogramas e indicaciones de peligro que se describen en la Tabla III. Estos serán como máximo dos y deberán ocupar cada uno de ellos como mínimo la décima parte de las superficies indicadas en la Tabla II.

Tabla III

Las frases de riesgo y seguridad son el instrumento básico para mantenerle informado sobre la clasificación y las precauciones más importantes de seguridad. La columna de etiquetado incluye datos abreviados de clasificación, los detalles de las frases requeridas de riesgo y seguridad para peligros para la salud, así como los criterios fisicoquímicos y medioambientales. La lista completa de las frases de riesgo y seguridad en diferentes idiomas puede encontrarse fácilmente en nuestra página web. El significado preciso de cada una de éstas se presenta en una tabla a continuación. Además, le ofrecemos una tabla en la que se exponen frases únicas y una segunda tabla en la se exponen combinaciones. De este modo tiene la información más importante de forma resumida. Le ofrecemos información detallada y completa y consejos adecuados sobre seguridad. Minimizar riesgos para un lugar de trabajo más seguro.

Información de riesgo (Frases R)

R 1 Explosivo en estado seco.

R 2 Riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.

R 3 Alto riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.

R 4 Forma compuestos metálicos explosivos muy sensibles.

R 5 Peligro de explosión en caso de calentamiento.

R 6 Explosivo en contacto o sin contacto con el aire.

R 7 Puede provocar incendios.

R 8 Peligro de fuego en contacto con materias combustibles.

R 9 Peligro de explosión al mezclar con materias combustibles.

R 10 Inflamable.

R 11 Fácilmente inflamable.

R 12 Extremadamente inflamable.

R 14 Reacciona violentamente con el agua.

R 15 Reacciona con el agua liberando gases extremadamente inflamables.

R 16 Puede explosionar en mezcla con substancias comburentes.

R 17 Se inflama espontáneamente en contacto con el aire.

R 18 Al usarlo pueden formarse mezclas aire-vapor explosivas/inflamables.

R 19 Puede formar peróxidos explosivos.

R 20 Nocivo por inhalación.

R 21 Nocivo en contacto con la piel.

R 22 Nocivo en caso de ingestión.

R 23 Tóxico por inhalación.

R 24 Tóxico en contacto con la piel.

R 25 Tóxico en caso de ingestión.

R 26 Muy tóxico por inhalación.

R 27 Muy tóxico en contacto con la piel.

R 28 Muy tóxico por ingestión.

R 29 En contacto con agua libera gases tóxicos.

R 30 Puede inflamarse fácilmente al usarlo

R 31 En contacto con ácidos libera gases tóxicos.

R 32 En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos.

R 33 Peligro de efectos acumulativos.

R 34 Provoca quemaduras.

R 35 Provoca quemaduras graves.

R 36 Irrita los ojos.

R 37 Irrita las vías respiratorias.

R 38 Irrita la piel.

R 39 Peligro de efectos irreversibles muy graves.

R 40 Posibles efectos cancerígenos.

R 41 Riesgo de lesiones oculares graves.

R 42 Posibilidad de sensibilización por inhalación.

R 43 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.

R 44 Riesgo de explosión al calentarlo en ambiente confinado.

R 45 Puede causar cáncer.

R 46 Puede causar alteraciones genéticas hereditarias.

R 48 Riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada.

R 49 Puede causar cáncer por inhalación.

R 50 Muy tóxico para los organismos acuáticos.

R 51 Tóxico para los organismos acuáticos.

R 52 Nocivo para los organismos acuáticos.

R 53 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.

R 54 Tóxico para la flora.

R 55 Tóxico para la fauna.

R 56 Tóxico para los organismos del suelo.

R 57 Tóxico para las abejas.

R 58 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente.

R 59 Peligroso para la capa de ozono.

R 60 Puede perjudicar la fertilidad.

R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.

R 62 Posible riesgo de perjudicar la fertilidad.

R 63 Posible riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.

R 64 Puede perjudicar a los niños alimentados con leche materna.

R 65 Nocivo: si se ingiere puede causar daño pulmonar.

R 66 La exposición repetida puede provocar sequedad o formación de grietas en la piel.

R 67 La inhalación de vapores puede provocar somnolencia y vértigo.

R 68 Posibilidad de efectos irreversibles.

Información de seguridad (Frases S)

S 1 Consérvese bajo llave.

S 2 Mantener fuera del alcance de los niños.

S 3 Consérvese en lugar fresco.

S 4 Manténgase lejos de locales habitados.

S 5 Consérvese en ... (líquido adecuado que especificará el fabricante).

S 5,1 Consérvese en agua.

S 5,2 Consérvese en petróleo.

S 5,3 Consérvese en aceite de parafina.

S 6 Consérvese en ... (gas inerte que especificará el fabricante).

S 6,1 Consérvese en nitrógeno.

S 6.2 Consérvese en argón.

S 6,3 Consérvese en gas protector.

S 7 Mantener el recipiente cerrado herméticamente.

S 8 Manténgase el recipiente en lugar seco.

S 9 Manténgase el recipiente en lugar bien ventilado.

S 12 No cerrar el recipiente herméticamente.

S 13 Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos.

S 14 Consérvese lejos de ... (incompatible materials to be indicated by the manufacturer).

S 14.1 Consérvese lejos de reductores, compuestos de metales pesados, ácidos y álcalis.

S 14.10 Consérvese lejos de ácidos, reductores y materiales combustibles.

S 14.11 Consérvese lejos de sustancias combustibles.

S 14.12 Consérvese lejos de lejías y sustancias alcalinas.

S 14.2 Consérvese lejos de sustancias oxidantes y ácidas y de compuestos de metales pesados.

S 14.3 Consérvese lejos de hierro.

S 14.4 Consérvese lejos de agua y lejías.

S 14.5 Consérvese lejos de ácidos.

S 14.6 Consérvese lejos de lejías.

S 14.7 Consérvese lejos de metales.

S 14.8 Consérvese lejos de sustancias oxidantes y ácidas.

S 14.9 Consérvese lejos de sustancias orgánicas combustibles.

S 15 Conservar alejado del calor.

S 16 Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar.

S 17 Manténgase lejos de materias combustibles.

S 18 Manipúlese y ábrase el recipiente con prudencia.

S 20 No comer ni beber durante su utilización.

S 21 No fumar durante su utilización.

S 22 No respirar el polvo.

S 23 No respirar los gases, humos, vapores,a erosoles (appropriate wording to be specified by the manufacturer).

S 23.1 No respirar el gas.

S 23.2 No respirar los vapores.

S 23.3 No respirar los aerosoles.

S 23.4 No respirar el humo.

S 23.5 No respirar los vapores/aerosoles.

S 24 Evítese el contacto con la piel.

S 25 Evítese el contacto con los ojos.

S 26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.

S 27 Quítese inmediatamente la ropa manchada o salpicada.

S 28 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con ... (productos a especificar por el fabricante).

S 28.1 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua.

S 28.2 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua y jabón.

S 28.3 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua y jabón a ser posible también con polietilenglicol 400.

S 28.4 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con polietilenglicol 300 y etanol (2:1) y a continuación con abundante agua y jabón.

S 28.5 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con polietilenglicol 400.

S 28.6 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con polietilenglicol 400 y a continuación lavar con agua abundante.

S 28.7 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua y jabón ácido.

S 29 No tirar los residuos por el desagüe.

S 30 No echar jamás agua a este producto.

S 33 Evítese la acumulación de cargas electroestáticas.

S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles.

S 36 Úsese indumentaria protectora adecuada.

S 37 Úsense guantes adecuados.

S 38 En caso de ventilación insuficiente, úsese equipo respiratorio adecuado.

S 39 Úsese protección para los ojos/la cara.

S 40 Para limpiar el suelo y los objetos contaminados por este producto, úsese ... (productos a especificar por el fabricante).

S 40.1 Para limpiar el suelo y los objetos contaminados por este producto, úsese mucha agua.

S 41 En caso de incendio y/o de explosión no respire los humos.

S 42 Durante las fumigaciones/pulverizaciones, úsese equipo respiratorio adecuado

(appropriate wording to be specified by the manufacturer).

S 43 En caso de incendio, utilizar ... (indicar el tipo preciso de equipo de protección contra incendios)

No usar nunca agua.

S 43.1 En caso de incendio, utilizar agua.

S 43.2 En caso de incendio, utilizar agua o extintor de polvo.

S 43.3 En caso de incendio, utilizar extintor de polvo - no usar nunca agua.

S 43.4 En caso de incendio, utilizar carbono dióxido - no usar nunca agua.

S 43.6 En caso de incendio, utilizar arena - no usar nunca agua.

S 43.7 En caso de incendio, utilizar polvo extintor para metales - no usar nunca agua.

S 43.8 En caso de incendio utilizar arena, carbono dióxido o extintor de polvo - no usar nunca agua.

S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

S 46 En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al médico y muéstresele la etiqueta o el envase.

S 47 Consérvese a una temperatura no superior a ... °C (productos a especificar por el fabricante).

S 47.1 Consérvese a una temperatura no superior a 25 °C.

S 48 Consérvese humedo con ... (appropriate material to be specified by the manufacturer).

S 48.1 Consérvese húmedo con agua.

S 49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen.

S 50 No mezclar con ... (productos a especificar por el fabricante).

S 50.1 No mezclar con ácidos.

S 50.2 No mezclar con lejías.

S 50.3 No mezclar con ácidos fuertes, bases fuertes, metales no férricos y sus sales.

S 51 Úsese únicamente en lugares bien ventilados.

S 52 No usar sobre grandes superficies en locales habitados.

S 53 Evítese la exposición - recábense instrucciones especiales antes del uso.

S 56 Elimínense esta sustancia y su recipiente en un puesto de recogida pública de residuos especiales o peligrosos.

S 57 Utilícese un envase de seguridad adecuado para evitar la contaminación del medio ambiente.

S 59 Remitirse al fabricante o proveedor para obtener información sobre su recuperación/reciclado.

S 60 Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos.

S 61 Evitar su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad.

S 62 En caso de ingestión no provocar el vómito: acúdase inmediatamente al médico y muéstresele la etiqueta o el envase.

S 63 En caso de accidente por inhalación,alejar a la víctima fuera de la zona contaminada y mantenerla en reposo.

S 64 En caso de ingestión, lavar la boca con agua (solamente si la persona está consciente).

Combinación de Frases S

S 1/2 Consérvese bajo llave y manténgase fuera del alcance de los niños.

S 3/7 Consérvese el recipiente bien cerrado y en lugar fresco.

S 3/9/14 Consérvese en lugar fresco y bien ventilado y lejos de... (materiales incompatibles serán indicados por el fabricante).

S 3/9/14,1 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de reductores, compuestos de metales pesados, ácidos y álcalis.

S 3/9/14,1/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de reductores, compuestos de metales pesados, ácidos y álcalis.

S 3/9/14,2 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de sustancias oxidantes y ácidas y de compuestos de metales pesados.

S 3/9/14,2/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de sustancias oxidantes y ácidas y de compuestos de metales pesados.

S 3/9/14,3 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de hierro.

S 3/9/14,3/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de hierro.

S 3/9/14,4 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de agua y lejías.

S 3/9/14,4/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de agua y lejías.

S 3/9/14,5 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de ácidos.

S 3/9/14,5/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de ácidos.

S 3/9/14,6 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de lejías.

S 3/9/14,6/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de lejías.

S 3/9/14,7 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de metales.

S 3/9/14,7/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de metales.

S 3/9/14,8 Consérvese el recipiente en lugar fresco y bien ventilado y lejos de sustancias oxidantes y ácidas.

S 3/9/14,8/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen en lugar fresco y bien ventilado y lejos de sustancias oxidantes y ácidas.

S 3/9/14/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen, en lugar fresco y bien ventilado y lejos de... (materiales incompatibles serán indicados por el fabricante).

S 3/9/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen, en lugar fresco y bien ventilado.

S 3/14 Consérvese en lugar fresco y lejos de... (incompatible materials to be indicated by the manufacturer).

S 3/14,1 Consérvese en lugar fresco y lejos de reductores, compuestos de metales pesados, ácidos y álcalis.

S 3/14,2 Consérvese en lugar fresco y lejos de sustancias oxidantes y ácidas y de compuestos de metales pesados.

S 3/14,3 Consérvese en lugar y fresco lejos de hierro.

S 3/14,4 Consérvese en lugar fresco y lejos de agua y lejías.

S 3/14,5 Consérvese en lugar fresco y lejos de ácidos.

S 3/14,6 Consérvese en lugar fresco y lejos de lejías.

S 3/14,7 Consérvese en lugar fresco y lejos de metales.

S 3/14,8 Consérvese en lugar fresco y lejos de sustancias oxidantes y ácidas.

S 7/8 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar seco.

S 7/9 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.

S 7/47 Manténgase el recipiente bien cerrado y consérvese a una temperatura no superior a ... °C (productos a especificar por el fabricante).

S 20/21 No comer, ni beber, ni fumar durante su utilización.

S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.

S 27/28 Después del contacto con la piel, quítese inmediatamente toda la ropa manchada o salpicada y lávese inmediata y abundantemente con..... (productos a especificar por el fabricante).

S 29/35 No tirar los residuos por el desagüe; elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles.

S 29/56 No tirar los residuos por el desagüe. Elimínense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida pública de residuos especiales o peligrosos

S 36/37 Úsense indumentaria y guantes de protección adecuados.

S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.

S 36/39 Úsense indumentaria adecuada y protección para los ojos/la cara.

S 37/39 Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.

S 47/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen y a temperatura no superior a ... °C (productos a especificar por el fabricante).

Combinación de Frases R

R 14/15 Reacciona violentamente con el agua, liberando gases extremadamente inflamables.

R 15/29 En contacto con el agua, libera gases tóxicos y extremadamente inflamables.

R 20/21 Nocivo por inhalación y en contacto con la piel.

R 20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.

R 20/22 Nocivo por inhalación y por ingestión.

R 21/22 Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.

R 23/24 Tóxico por inhalación y en contacto con la piel.

R 23/24/25 Tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.

R 23/25 Tóxico por inhalación y por ingestión.

R 24/25 Tóxico en contacto con la piel y por ingestión.

R 26/27 Muy tóxico por inhalación y en contacto con la piel.

R 26/27/28 Muy tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.

R 26/28 Muy tóxico por inhalación y por ingestión.

R 27/28 Muy tóxico en contacto con la piel y por ingestión.

R 36/37 Irrita los ojos y las vías respiratorias.

R 36/37/38 Irrita los ojos, las vías respiratorias y la piel.

R 36/38 Irrita los ojos y la piel.

R 37/38 Irrita las vías respiratorias y la piel.

R 39/23 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación.

R 39/23/24 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación y contacto con la piel.

R 39/23/24/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, contacto con la piel e ingestión.

R 39/23/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación e ingestión.

R 39/24 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel.

R 39/24/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel e ingestión.

R 39/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por ingestión.

R 39/26 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación.

R 39/26/27 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación y contacto con la piel.

R 39/26/27/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, contacto con la piel e ingestión.

R 39/26/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación e ingestión.

R 39/27 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel.

R 39/27/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel e ingestión.

R 39/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por ingestión.

R 42/43 Posibilidad de sensibilización por inhalación y en contacto con la piel.

R 48/20 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación.

R 48/20/21 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación y contacto con la piel.

R 48/20/21/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación, contacto con la piel e ingestión.

R 48/20/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación e ingestión.

R 48/21 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por contacto con la piel.

R 48/21/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por contacto con la piel e ingestión.

R 48/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por ingestión.

R 48/23 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación.

R 48/23/24 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación y contacto con la piel.

R 48/23/24/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación, contacto con la piel e ingestión.

R 48/23/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación e ingestión.

R 48/24 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por contacto con la piel.

R 48/24/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por contacto con la piel e ingestión.

R 48/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por ingestión.

R 50/53 Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.

R 51/53 Tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.

R 52/53 Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.

R 68/20 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación.

R 68/20/21 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación y contacto con la piel.

R 68/20/21/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación, contacto con la piel e ingestión.

R 68/20/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación e ingestión.

R 68/21 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por contacto con la piel.

R 68/21/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por contacto con la piel e ingestión.

R 68/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por ingestión.

2. ESQUEMA DE IMPLEMENTOS DE LABORATORIO, TABLA DE MATERIALES, CARACTERISTICAS Y FUNCIONES

NO. ESQUEMA NOMBRE CARACTERISTICAS FUNCIONES CLASIFICACION

1

Probeta -Tubo de cristal alargado

-Presenta graduación

-Cerrado por un extremo

-Posee una base de vidrio que le sirve de apoyo

-Parte superior abierta y suele tener un pico

-Generalmente mide de 25 a 50 ml pero algunas llegan a medir hasta 2000 ml. Sirve como recipiente para líquidos y gases

-Mide el volumen de cada uno de ellos

Vidrio o plástico

2

Caja de Petri

-Recipiente redondo

-Posee diferentes diámetros

-Fondo bajo

-Cubierta del mismo material pero más grande de diámetro que le sirve como tapa -Se utiliza para observar diferentes tipos de muestras tanto biológicas como químicas

-Se utiliza para el cultivo de bacterias y otras especies

-Para masar sólidos en una balanza.

Vidrio o plástico

3

Pinza para tubo de ensayo -Tienen tipo de sujeción ajustable

-Compuesto por dos partes una llamada Vástago o varilla cilíndrica y otra llamada pinza con una estructura parecida a unas tenazas y compuesta de dos brazos que le permiten agarrar el tubo.

Sirve para sujetar los tubos de ensayo mientras se calientan o trabaja con ellos.

Madera o de metal

4

Gradillas para tubo de ensayo -Polipropileno opaco de alta densidad

-Fácilmente ensamblable

-Autoclavable

-Con enumeración lineal

-Fácil limpieza admite desinfectantes -Sirve para dar soporte a los tubos de ensayo o tubos de muestra

-Utilizable en baño de maría

Metálico, madera o de plástico

5

Espátula

-Lámina metálica plana y angosta

-Adherida a un mango que puede ser de madera, plástico o metal. -Utilizada para tomar pequeñas cantidades de compuestos o sustancias sólidas, especialmente granulares.

Metálico

6

Mortero

El mortero posee un instrumentopequeño creado del mismo material llamado mano o pilón que es el encargado de triturar.

Tiene como Finalidad machacar o triturar las sustancias solidas

Porcelana o madera

7

Crisol -Elaborado en porcelana

-Por ser de ese material resiste altas temperaturas.

-Recipiente en forma de vaso con abertura superior. -Utilizado principalmente para calentar, fundir, quemar y calcinar sustancias.

Porcelana

8

Malla de asbesto -Posee fibras largas y resistentes que se pueden separar y son flexibles como para ser entrelazados.

-Resisten altas temperaturas.

-Encargada de repartir la temperatura de manera uniforme cuando se calienta con un mechero

Metálico

9

Papel de filtro -Fabricado con linters de algodón y fibras vegetales de elevada pureza

-Poder de filtración rápida o muy rápida

-Compuesto por papel de celulosa fina

Sirve para filtrar y se debe colocar sobre el embudo de vidrio.

Utilizado para la identificación de sustancias

Papel

10

Embudo de decantación

-Es un recipiente ovalado

-En un extremo tiene una boca estrecha cerrada por un tapón y una llave de paso en el otro que se puede abrir y cerrar a voluntad, seguida de un tubo estrecho de 5 a 10 cm.

Sirve para retener disoluciones y decantarlas donde y con la cantidad que se desee

Cristal

11

Embudo de filtración

Hay dos tipos :

1. embudo cónico

2. embudo buchner -Sirve para introducir líquidos en recipientes de boca estrecha o para filtrar si en su interior se ubica un poco de papel de filtro. (Embudo cónico)

Se utiliza para filtrar a vacío con la ayuda de un matraz quita satos (embudo buchner)

Cristal y porcelana respectivamente

12

Termómetro

-Es un instrumento de precisión, delicado por lo tanto requiere muchos cuidados.

-Debe manejarse limpio para introducirlo en el líquido o solución cuya temperatura se quiere encontrar.

-Se emplea para medir temperaturas en operaciones de destilación, para determinación de puntos de fusión.

Son instrumentos destinados a medir temperaturas en grados centígrados o Fahrenheit.

Vidrio

13

Mechero

-Llamado también encendedor.

-Consta de un tubo metálico con una entrada regulable de aire en su base y una boquilla de variados diseños en su parte superior.

- genera energía calorífica mediante la quema de combustible (gas propano, butano, alcohol, etc)

-calentador para acelerar las reacciones químicas de las sustancias o con el color de la llama distinguir algún elemento.

Vidrio y metálico

14

Agitadores o varillas de vidrio

-Fino cilindro macizo de vidrio

-Suelen ser de 5 a 6 mm de diámetro y de 200 a 500 mm de longitud

Sirve para agitar disoluciones, mezcla productos químicos y líquidos en el laboratorio

Cristal o vidrio macizo

15

Gotero -Compuesto por un tubo hueco en vidrio terminado en su parte inferior en forma cónica y cerrada y por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Utilizado para traspasar líquidos de un recipiente a otro cuando se es necesario realizar mediciones pequeñas y con precisión.

Vidrio o plástico

16

Lupa

-Instrumento óptico cuya parte principal en una lente convergente

-Montada en un soporte por lo general circular.

-Puede o no contar con un mango para mayor comodidad en su uso

Se emplea para ampliar la imagen de un objeto que se quiere estudiar

Vidrio

17

Capsula de porcelana

-Resiste elevadas temperaturas

-Al usarse no debe estar vencida puede llegar a estallarse

-recipiente elaborado en porcelana con poca profundidad en relación con su diámetro. -Sirve para calentar y evaporar líquidos, fundir y cristalizar sólidos.

-Permite carbonizar o fundir elementos químicos

Porcelana

18

Triangulo de porcelana

- Fabricado en porcelana y alambre, consta de tres lados que permite mayor fijación. Se utiliza para colocar la capsula de porcelana si se va a realizar procesos de laboratorio como fundición.

Sirve de sostén a la capsula de porcelana

Porcelana

19

Soporte universal

-Está formado por una base o pie en forma de semicírculo o de rectángulo, y desde el centro de uno de los lados, tiene una varilla cilíndrica que sirve para sujetar otros elementos a través de doble nueces. -Sirve para fijar los equipos y utensilios mediante pinzas

-Permite realizar montajes con los materiales presentes en el laboratorio y obtener sistemas de medición o de diversas funciones

Metálico

20

Aro metálico

-En sus costados cuenta con un sistema de sujeción parecida a una nuez

-Fabricado en hierro colado

-Anillo circular de fiero -Se emplea como soporte de otros materiales anexado al soporte universal o para poner frascos de vidrio sobre el mechero

Metálico

21

Pinza metálica para crisol

-Elemento fabricado en hierro

Se emplea para sujetar los crisoles con el fin de darle una mayor fijación y facilidad de manejo

Metálico

22

Mangueras y tapones de caucho

-Instrumento de caucho

-Conductos de goma o recubrimientos de goma de distintos tamaños -Se utilizan para traspasar líquidos o gases de un recipiente a otro ya sea para formar soluciones o reacciones químicas.

-Los tapones cumplen con la función de una tapa sellando contenedores o recipientes.

Plástico

23

Churrusco

-Fabricado con mechón de pelo natural

- Se encuentran en diferentes diámetros

-Presentan un soporte en alambre que sirve de agarradera

Se utiliza para el lavado y limpieza de los tubos de ensayo, vasos de precipitado, buretas etc.

Alambre y material sintético

24

Balanza

-Cuentan con una alta resolución y precisión

-Los platillos de la balanza son en acero inoxidable.

-Existen diversas balanzas como son la granatoria, analítica la cual puede ser digital desplegando la información en distintos sistemas de unidades.

-Su uso corresponde a determinar la masa de una sustancia o pesar cierta cantidad de la misma.

Metálico

25

Microscopio -El invento del microscopio parece remontarse a la edad Media cuando en 1590 los hermanos Jansen en Holanda inventaron el microscopio compuesto aunque este daba una imagen borrosa, llegándose al siglo XIX con los adelantos científicos modificar a un microscopio con medios ópticos acromáticos excelentes

-Compuesto de dos lentes llamados objetivos y ocular

-Es uno de los elementos fundamentales de un laboratorio.

Se utiliza para hacer visible objetos muy pequeños que a simple vista no se verían.

Metálico

26

Microscopio Estereoscopio

-Posee dos lentes objetivo y una profundidad de foco mayor que la del microscopio

-Produce imágenes tridimensionales

-El poder de resolución es menor que el del microscopio

- Se usa para estudiar objetos relativamente grandes

Metálico

27

Autoclave

- Recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial.

-Los equipos utilizados para esterilizar con óxido de etileno se denominan de la misma forma.

-usado para esterilizar instrumental y otro producto sanitario.

- usado para esterilizar material de laboratorio

Metálico

28

Tubo de ensayo

Vaso de precipitados

Matraz Erlenmeyer

Matraz de fondo plano

Matraz de destilación.

-Materiales en los que se combinan sustancias

-Se considera un pequeño tubo para meter muestras

-forma parte del material de vidrio de un laboratorio químico

principal material que conlleva la preparación de soluciones

Vidrio

29

Probeta

Pipeta

Bureta

Matraz aforado

Materiales para medir volúmenes

se usa en los laboratorios para medir líquidos o gases

permite medir volúmenes superiores y más rápidamente que las pipetas, aunque con menor precisión

Vidrio

30

Materiales de soporte y sujeción Soporte universal con anillo de fierro, pinzas para bureta y tela de alambre con asbesto

Gradilla para tubos de ensayo

Tripié y triángulo de porcelana

Pinzas para tubo de ensayo

Pinzas para crisol

Pinzas de 2 o 3 dedos con nuez

sirven para sujetar los tubos

Metálica

31

Otros materiales del laboratorio escolar Lámpara de alcohol

Embudo

Vidrio de reloj

Cápsula de porcelana

Mortero con pistilo

Cuba hidroneumática

Cucharilla de combustión

Agitador de vidrio

Frascos goteros

Espátula

Tapones

Escobillones Son cucharas de mango delgado y muy largo, para la combustión

Permiten sujetar tubos de ensayo y si éstos se necesitan calentar, siempre se hace sujetándolos con estas pinzas

Metálica

32

Instrumentos para medir

Balanza de dos platillos y marco de pesas

Regla de 1 m

Flexómetro

Vernier

Balanza granataria

Dinamómetro

Termómetro

Barómetro

Brújula

Instrumento de medición de temperatura

Vidrio y mercurio

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Otros instrumentos y aparatos que usamos son:

Poleas

Plano inclinado

Anillo de Gravesande

Diapasón

Lupa

Lentes

Electroscopio

Imanes

Elementos necesarios para el desarrollo del laboratorio

Vidrio, metal, madera

3. Refractario: material, que es capaz de mantener sus propiedades a elevadas temperaturas por excelencia son las cerámicas o de vidrio especial llamado pirex denominado implementos de vidrio refractario, ya que nos permiten hacer calentamientos a la llama del mechero o al baño de María

El vidrio no refractario, es aquel que no resiste elevaciones o disminuciones bruscas de temperatura. Los implementos de vidrio no refractario no deben calentarse a la llama del mechero por ningún motivo.

El material de vidrio de laboratorio puede clasificarse en dos categorías:

Vidriería Común. Comprende los vasos de precipitados, los Erlenmeyer, los balones de fondo plano y de fondo redondo, los embudos (al vacío, por gravedad, de decantación), tubos de ensayo, condensadores, frascos con tapón esmerilado, vidrios de reloj, tubos de Thiele y otros (figura 1).

Figura 1. Equipo básico de laboratorio (I)

Vidriería Volumétrica (de alta precisión). Este material suele ser más costoso debido al tiempo gastado en el proceso de calibración. Comprende una serie de recipientes destinados a medir con exactitud el volumen que “contienen” o el volumen que “vierten”. En los recipientes volumétricos aparece señalado si el recipiente es para verter o para contener, lo mismo que la temperatura a la cual ha sido calibrado (figura 2).

Figura 2. Equipo básico de laboratorio (II)

4. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

Mediante la observación de los microorganismos vivos podemos observar y estudiar su movilidad, su morfología e incluso algunas de sus estructuras, sin olvidar, la observación de huevos y quistes de algunos parásitos, importantísimos en el análisis microbiológico.

Para efectuar esta observación microbiológica, podemos emplear directamente los productos patológicos o bien acudimos a los cultivos nacientes de medios de cultivo sólidos o líquidos.

Los métodos que se emplean en la observación de estos microorganismos son los exámenes en fresco, en el que incluimos las preparaciones húmedas, la gota pendiente y el examen en fresco de nombre “nigrosina”, y los colorantes vitales en los que teñimos las células gracias a los colorantes muy bien diluidos.

4.1 PREPARACIONES HÚMEDAS:

Para las preparaciones con material patológico líquido o medio de cultivo líquido se tomará una gota, se depositará sobre un portaobjetos, se cubrirá evidentemente con un cubre y se llevará la observación al microscopio con el objetivo de inmersión y luz exigua; mientras que para las preparaciones con material patológico sólido o medio de cultivo sólido se coloca sobre el porta una gota de agua destilada estéril, se cargará sobre la misma el material a reconocer con el asa estéril, lo cubrimos con el cubre y procederemos a la observación propiamente dicha al microscopio con el objetivo de inmersión.

Método de gota pendiente, se necesitará un porta excavado y un cubre, para luego depositar el material observante en el mismo, llevando a cabo un volteo al porta, y finalmente se procede a la observación de la movilidad del microorganismo; utilizando la inmersión y el uso de una luz tenue.

Por último, en las coloraciones vitales, empleada en la observación de los mínimos pormenores de la estructura celular, se vale de colorantes muy diluidos (1/1000; 1/10.000), por lo que jamás se empleará en este proceder los colorantes puros. El que más empleamos es la correcta dilución del azul de metileno, para tomar luego una gota de la misma y colocarlo sobre el porta y sobre la misma añadir una gota del medio de cultivo líquido, a no ser que se opte por la solución con la muestra sólida tomada de una placa de cultivo. Efectuado dichos pasos, se procede al empleo de un cubre sobre la mixtura realizada y así llevarla a observación al microscopio con el empleo del objetivo de inmersión. Igualmente, algunos laboratoristas optan por la añadidura del colorante una vez ya colocado el cubre, por medio de una pipeta que suelta por capilaridad la empleada carga tintosa.

4.2 PREPARACIÓN FIJADA:

Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos). Después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión.

5. EQUIPOS PARA REALIZAR LABORATORIO DE MICROORGANISMOS

MICROSCOPIO: es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación utilizada.

El cual nos permite observar como su nombre lo dice micros que quiere decir algo muy pequeño, luego el reactivo, le sique el colorante cuando lo requiere el laboratorio, usina o fucsina, caja de Petri, aguja esterilizada, cubre objetos porta objetos, agujas alfileres, bisturí o cuchilla (navaja), guantes, bata ojala blanca, tapabocas, bayetilla entre otros.

EL AUTOCLAVE: es un dispositivo que sirve para esterilizar material médico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura. El autoclave coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, así como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.

Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15 minutos.

LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR: nos sirve para mantener un área de trabajo estéril, funciona por medio de absorción de aire del medio ambiente el cual es filtrad, para después expulsar el aire limpio sin microorganismos. En la campana también podemos utilizar la luz ultra violeta para mantener el área estéril hay que mantenerla encendida por 30 minutos, por recomendación no hay que acercarse a la luz por que puede causar quemaduras severas.

INCUBADORA: nos sirve para mantener un lugar óptimo para el desarrollo y crecimiento de microorganismos, tiene dos divisiones, en él se ponen los microorganismos y se regula a que temperatura se debe mantener por lo general es a una temperatura de 38°, no importa la temperatura del exterior dentro el ya no existen variaciones.

JARRA DE ANAEROBIOSIS: este aparato sirve para mantener bacterias anaerobias. Tiene unos tubos en donde se conectan a una máquina que succiona el aire. La tapa tiene un catalizador para facilitar el proceso.

6. TECNICA DE TINCION O COLORACION DE BACTERIAS

Los procedimientos que ponen de manifiesto diferencias entre las células bacterianas o en partes una célula se conoce como técnica de coloraciones diferenciales. Son algo más que elaboradas que la técnica simple en la que las células se someten a una sola solución colorante o reactivo colorante. Las tinciones se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El método, por consiguiente, es bastante drástico y puede producir artificios.

Las tinciones más frecuente son sales. Las tinciones básicas consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro, mientras las ácidas constituyen exactamente lo contrario, unido a dos cationes. Las células bacterianas son abundantes en ácidos nucleicos, los cuales portan cargas negativas en formas de fosfatos. Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para teñir al fondo con un color de contraste. Las tinciones básicas tiñen uniformemente en las células bacterianas, a menos que antes de destruyan el ARN del citoplasma. También se pueden usar técnicas de tinción especiales para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, gránulos, nucleótidos y esporas.

TINCION ACIDORRESISTENTE

Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun cuando intente descolorarlas con una mezcla de alcohol y ácido clorhídrico. Las bacterias acidorresistentes se tiñen de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en este caso el verde o azul.

TINCION NEGATIVA

Este procedimiento consiste en la tinción de fondo con un colorante ácido para dejar las células incoloras en contraste. Comúnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusína. El método sirve para observar bacterias o estructuras que difícilmente se tiñen con las técnicas directas.

TINCION DE LOS FLAGELOS

Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensión coloidal inestable de sales de ácidos tánico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden poner de manifiesto su presencia y disposición en las células. De esta manera el diámetro aparenta que la estructura aumento de tamaño con fuscina básica los hace visibles en el microscopio óptico.

TINCION DE LA CAPSULA

La cápsula se pone de manifiesto mediante una coloración negativa o una modificación de esta. Uno de los métodos de ´´ tinción de la cápsula ´´ incluye el tratamiento de las bacterias con un solución caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solución de sulfato de cobre. El sulfato de cobre también imparte color al fondo y esto resulta en que la célula y el fondo aparezcan teñido en color azul oscuro mientras la cápsula aparece de color azul pálido.

TINCION DEL NUCLEO

Los núcleos se pueden teñir por la tinción de Feulgen la cual es específica para el ADN.

TINCION DE LAS ESPORAS

Las esporas se observan de la manera más simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teñir, la parte de las esporas relativamente impermeable, las esporas comúnmente se tiñen con verde de malaquita y carbol fucsina o carbol fucsina

TINCION GRAM

Una característica taxonómica importante de las bacteria es su respuesta a la tinción a de Gram esta característica parece ser fundamental, reacción a la tinción se correlaciona a con muchas otras propiedades morfológicas en maneras relacionadas filogenéticamente. Microorganismo potencialmente grampositivo puede verse como tal cuando concurre un conjunto de particular de condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento para tinción de Gram se inicia con la aplicación de un colorante básico el cristal de violeta. Luego se aplica una solución de yodo en este momento todas las bacterias de tiñen de azul. Continuación las células se tratan con alcohol las células grampósitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran completamente por el alcohol. Por último se aplican un colorante de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera, las células gramnegativas, previamente descoloradas, toman el colorante de contraste y las células grampositivas ahora aparecen púrpura.

7. TECNICAS DE CORTES DE TEJIDOS

El desarrollo de la biología celular y molecular se produce en forma paralela a la invención de instrumentos y técnicas biofísicas y bioquímicas que extienden los sentidos a nuevos límites y acrecientan el conocimiento de la estructura y funcionamiento de la célula. El acceso a este tipo de conocimiento resulta dificultoso pues las células son pequeñas y transparentes. El ojo humano sólo puede discriminar dos puntos separados por más de 0,1 mm ó 100 micrómetros (mm). La mayoría de las células son mucho más pequeñas y se necesita del microscopio óptico cuyo límite de resolución es de 0,2 mm. Para estructuras más pequeñas, que midan entre 0,4 y 200 nanómetros (nm), se requiere del microscopio electrónico.

Como se aprecia, las principales unidades de medida que se emplean corrientemente en microscopia no son las de uso cotidiano. En la siguiente tabla se expresan aquellas unidades y sus equivalencias:

Tabla 1.11-Medidas utilizadas en microscopia

Unidad Símbolo Equivalencia en metro (m) Utilización principal en citología

Centímetro cm 0,01 metro Objetos macroscópicos a simple vista. Huevos grandes.

Milímetro mm 0,001m Objetos macroscópicos a simple vista. Células muy grandes.

Micrómetro mm 10-6 m Microscopia de luz (óptica)

Casi todas las células y organelos grandes.

Nanómetro nm 10-9 m Microscopia electrónica.

Organelas pequeñas, macromoléculas grandes.

Angstrom Å 10-10 m Microscopia electrónica. Métodos de difracción de rayos X. Moléculas y átomos.

CITOQUIMICA

La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica.

En una reacción bioquímica hay tres pasos fundamentales:

1.- Fijación: para preservar las estructuras y reactividad funcional celulares evitando fenómenos nocivos para las mismas e impidiendo también la difusión de componentes bioquímicos entre los diferentes compartimentos celulares así como al medio extracelular. Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehído, formaldehído, etc.

2.- Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se liberar unos productos que bien por sí mismos, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reacción.

3.- Contraste: para resaltar en lo posible el producto de reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y del citoplasma.

Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

HIBRIDACIÓN- de ácidos nucleídos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleídos anti paralelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

HIBRIDACION IN SITU

INMUNOCITOQUIMICA La técnicas de inmunocitoquímica son técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en los extendidos estudiados, Se utilizan anticuerpos marcados y con la reacción antígeno anticuerpo las estructuras que queremos demostrar se colorean con diferentes reactivos.

La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico en el que se encuentra permitiendo analizar su distribución en células y tejidos. Esta técnica, de la que han surgido diferentes variantes, se basa en la complementariedad de las bases que componen los ácidos nucleicos: G con C y A con T en el caso del ADN y G con C y A con U en el caso del ARN. Se diseña una sonda marcada con un fluorocromo que hibride con la secuencia a detectar. Este sistema nos permite estudiar la distribución in situ de una determinada secuencia de interés. Secuencias de interés médico pueden ser aquellas asociadas a enfermedades de origen genético, las que revelan la presencia de algún patógeno, las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores o las que se emplean como indicadores de alteraciones numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo. La detección se lleva a cabo marcando previamente la sonda a hibridar con la secuencia de interés con un fluorocromo. El siguiente paso es la hibridación de la secuencia marcada con las muestras problema, aplicándola directamente sobre células extendidas o tejidos. La detección de la fluorescencia emitida permite identificar la presencia de la secuencia y su localización exacta en la muestra.

Las técnicas de inmunocitoquímica permiten la identificación, sobre muestras citológicas, de antigénicos específicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular. Es una técnica sencilla que tiene diferentes aplicaciones: se emplea para la diferenciación de tumores, cuando es necesario localizar un tumor primario desconocido, para determinar la naturaleza de micrometástasis, para tipificar linfomas y leucemias, con el fin de precisar el tratamiento, para la detección de factores de valor predictivo como los receptores de estrógenos y de progesterona en casos de cáncer de mama, y para contribuir a establecer tratamientos adecuados en cáncer de mama (Herb2).

AUTORADIOGRAFIA

La autorradiografía es una técnica utilizada para estudiar el metabolismo celular y la localización de las sustancias en la célula. Se ha aplicado principalmente para estudiar la síntesis y la localización de los ácidos nucleicos y proteínas. Este método se basa en el principio de que, cuando los residuos se pone en contacto con una emulsión fotográfica (suspensión de sales de plata en la masa de gelatina), la radiación ionizante despierta la sensibilidad a los puntos de emulsión irradiados.

La autorradiografía es básicamente radio marcado moléculas implicadas como precursoras de un proceso metabólico determinado, y luego fijar los intervalos de tiempo los tejidos, proceso que mediante técnicas histológicas y, finalmente, cubrir los cortes con una emulsión fotográfica. El precursor puede ser añadido al medio en el que el organismo crece o se inyecta en él. La presencia de moléculas marcadas en ciertas estructuras se comprobará en la emulsión fotográfica después del desarrollo.

CROMATOGRAFIA

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

• Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos. Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.

Por lo general, para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño, medido en pares de bases

EL CULTIVO CELULAR

Es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50,1 pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.

Cambios de medio: El objetivo de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulación de productos metabólicos potencialmente tóxicos y de células muertas. En el caso de las suspensiones celulares, las células se separan del medio mediante centrifugación y se re suspenden en medio fresco. En los cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiración y reemplazarse por el fresco.

Técnicas de introducción de moléculas en las células:

La posibilidad de introducir ácido nucleico en el interior de las células ha permitido el desarrollo del conocimiento de la regulación génica y la función de las proteínas en células eucariotas, tejidos y organismos. Los primeros estudios realizados por Pagano y Vaheri (53), Graham y Van Der Eb (31), con las técnicas de transfección mediadas por DEAE dextrano y fosfato de calcio, abrieron el camino a los siguientes experimentos donde se necesitaba transferir ADN dentro de células.

Las células vivas presentan una barrera a la libre difusión de moléculas, la membrana plasmática, la cual evita la pérdida de componentes fundamentales e impide la entrada de moléculas externas, por ello posibilita la existencia de gradientes de concentración de productos a través de la membrana.

Para poder superar esta barrera se han diseñado muchas estrategias experimentales, unas basadas en la formación de poros más o menos permanentes y las otras en la vehiculización de moléculas mediante el uso de las vías naturales de entrada de macromoléculas; la endocitosis.

Entre las estrategias diseñadas podemos señalar las siguientes:

• Técnicas de permeabilización celular

• Técnicas de Microinyección

• Técnicas Transfección celular.

• Técnicas de Transducción

Técnicas de permeabilización celular:

Se trata de técnicas que permiten mantener las células vivas, inmersas en una solución, durante un periodo de tiempo que no suele superar las pocas horas, en condiciones tales que se produzca gran cantidad de orificios en la membrana. Cualquier molécula añadida a la solución que las rodea, penetra en la célula gracias al gradiente de concentración (60).

El medio que rodea la célula está formado por dos componentes importantes:

• Se requiere aportar externamente una fuente de energía (ATP), debido a que la pérdida de los gradientes electroquímicos de membrana impide que la célula regenere el ATP consumido.

• Un extracto citosólico procedente de sistemas homólogos o heterólogos. Su función es reducir en lo posible la pérdida de componentes vitales para el funcionamiento celular.

Estos sistemas de células permeabilizados son ampliamente empleados en estudios de identificación de factores solubles importantes en los procesos celulares, pero presenta dos grandes inconvenientes: la escasa duración del ciclo celular viable, y la pérdida incontrolable de componentes celulares que pueden ser vitales para el funcionamiento celular (a excepción de cuando se emplea el extracto citosólico de la propia célula) (60).

Frecuentemente se utiliza la técnica de electroporación para lograr la permeabilización de la membrana. Se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto. Las células despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas que se encuentran alrededor. Los impulsos eléctricos utilizados modifican transitoriamente las propiedades de la membrana celular, resultando en la permeabilización reversible de la célula (49). Pasada la despolarización, muchas células sufren daños irreparables y mueren (en muchos casos más del 90%), pero algunas (5 al 10%) se recuperan e incorporan las moléculas deseadas. La ventaja de esta técnica es que se aplica a millones de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% en las células que sobreviven. Es una técnica que requiere su ajuste para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones óptimas de duración y potencia del pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que aseguran la entrada en la célula y las que maximizan la viabilidad celular (60).

Técnicas de Microinyección:

La microinyección es una tecnología que permite la introducción mecánica de soluciones en el interior de la célula mediante una micropipeta que se controla con la ayuda de un micromanipulador, bajo un microscopio de alta resolución

Es una técnica muy sensible, que requiere una gran especialización del personal que la realiza y un equipo delicado, sofisticado y costoso. Los instrumentos modernos de microinyección, manipulados por personal experto, permiten realizar algunas decenas de inyecciones por hora de trabajo, por lo que resulta ser un sistema tedioso, que permite manipular pocas docenas o escasos cientos de células con gran dificultad (60).

La fertilización por microinyección es una importante innovación surgida en los últimos años, que finalmente ha resultado en un tratamiento viable, incluso, en los casos más difíciles de esterilidad masculina (41).

Existen además sistemas de microinyección biológicos, como los virus, que inoculan su material genético dentro de la célula hospedadora, y es por

ello que son muy usados como vectores sobre sistemas de células de mamíferos (64; 73).

Técnicas de transfección celular:

Las técnicas de transfección son la imagen de las técnicas de transformación en procariotas, se basan en la inserción de material exógeno en el genoma de ese organismo (11; 26).

Estas técnicas han sido desarrolladas específicamente para la introducción de ácidos nucleicos dentro de las células, y han permito ampliar los conocimientos que se tenían sobre replicación, regulación génica y el funcionamiento de las células a nivel molecular, entre otras, que actualmente se aplican en el campo de la genética para la producción de plantas y animales transgénicos (8), líneas celulares modificadas (2; 17), y la construcción de ADN recombinante (27; 29; 80).

La introducción de una cadena de ADN recombinante en las que se ha situado una secuencia codificante, bajo una secuencia de regulación que se desea estudiar, permite medir con facilidad las tasas de expresión genética en diferentes situaciones experimentales. Por otro lado, la introducción de un plásmido con secuencias codificante y reguladora permite la producción de una proteína deseada. En este caso se emplea a la célula hospedadora como una "fábrica" para este producto (60). Es importante la selección de las células que han recibido el material genético incorporado, de las que no. Para ello se puede realizar un cultivo en medio selectivo, puesto que normalmente los plásmidos que se insertan incluyen también marcadores de selección (4; 60).

Existen diversos métodos para introducir y expresar genes en las células. Algunos se utilizan para la expresión transitoria o temporal de los genes. Estos permiten evaluar la transcripción o la replicación de genes transfectados varios días después de la introducción del ADN. Otros métodos permiten la expresión estable o permanente, al menos durante un extenso periodo, es útil en los experimentos donde se requiera la formación de líneas celulares que contengan genes que se integren en el ADN cromosomal (26; 79).

De forma general las técnicas de transfección se pueden dividir en dos grupos: Métodos químicos y Métodos físicos.

Métodos químicos de transfección celular: Son aquellos en los que se forman complejos para que las células sean capaces de aceptar o incorporar una cierta molécula a su citoplasma, por medio del mecanismo normal de endocitosis. Durante años se han desarrollado diversos reactivos de transfección con esta finalidad, todos con características propias. Entre ellos podemos citar el fosfato de calcio (9; 28), el DEAE dextrano (10) y la lipofección (45; 52). Los dos primeros se unen al ADN formando complejos asimilables por la célula, mientras que la lipofección se basa en el recubrimiento de la molécula de ADN en un complejo de lípidos capaces de atravesar la membrana.

Recientemente se han diseñado varios reactivos comerciales que facilitan los métodos químicos de transfección (36), como por ejemplo el juego de reactivos de formulación no liposomal FuGeneTM 6, que se caracteriza por producir altos niveles de transfección para una amplia variedad de líneas celulares eucariotas con mínima citotoxicidad (http:// biochem.boehringer-mannheim.com).

a) Método de fosfato de calcio:

Este procedimiento ha sido empleado por más de 20 años para la transferencia y expresión de información genética en células de mamíferos. Fue descrito por primera vez para la introducción de ADN de adenovirus en células de mamíferos por Graham y Van Der Eb en 1973 (31) y se ha convertido en una de las técnicas más populares para la transfección estable o transitoria de células de mamíferos, siendo estudiada en detalles por varios grupos en el mundo (9; 28).

Se basa en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el ADN en una solución salina de fosfatos, formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al ADN de la degradación por las nucleasas celulares.

El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución. Otros factores que intervienen en la eficiencia de la transfección son la cantidad de ADN en el precipitado, el tipo de célula a utilizar y el tiempo de exposición de las mismas al precipitado (28).

El método del fosfato de calcio ha sido utilizado en el análisis de la replicación del ADN y la funcionalidad de los promotores en experimentos transitorios y la utilización de líneas celulares establemente transfectadas. Tiene como ventajas que permite introducir ADN en células eucariotas de forma estable o transitoria, requiere de reactivos baratos y de uso frecuente, y un equipamiento tradicional para un laboratorio dedicado al trabajo con líneas celulares. Además, puede ser aplicado a una cantidad relativamente grande de células en placas de cultivo. Sin embargo está limitado por la proporción variable y frecuentemente baja de células que toman el ADN exógeno (28).

b) Método con DEAE dextrano:

El diethyl aminoethyl dextrano (DEAE dextrano) es un polímero catiónico derivado del dextran y su carga positiva le permite unirse a los enlaces aniónicos fosfodiester del ADN. Estos complejos formados entre el ADN y el dextrano mantienen su carga positiva, lo que le permite unirse a la superficie de la célula cargada negativamente y pasa al interior de la célula mediante endocitosis (70).

Este método fue empleado originalmente para facilitar la entrada de ARN de poliovirus a células (53) y posteriormente para introducir ADN del virus SV40 (47).

Tiene como ventajas su sencillez, reproducibilidad y bajo costo, además de que se requiere de pocas cantidades de ADN. Entre sus desventajas se puede señalar el número limitado de líneas celulares en las cuales se pueden obtener resultados eficientes y su limitación a transfecciones transientes de ADN en la célula huésped debido a la toxicidad del DEAE.

Este método ha sido utilizado en el estudio de expresión de proteínas recombinantes (10) y la transfección de genomas virales y plásmidos (7). Puede estar interferido por la concentración de DEAE dextrano, el tiempo de exposición, la concentración de ADN, y el número y tipo de células (20).

c) Método de Lipofección:

Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y ADN, llamados liposomas. Dicho complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del ADN en el citosol.

La lipofección es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Se emplea en la introducción de ADN recombinante en las células embrionarias, en el proceso de obtención de animales transgénicos y en la terapia génica (52). Es fácilmente reproducible, se describe tanto para expresión transitoria como estable, resultando la expresión estable 5-100 veces más eficiente, que por el resto de los métodos químicos, y en la expresión estable se obtiene 3-20 veces mayor frecuencia de transfección. Tiene la habilidad de transfectar ciertos tipos de células donde no resultan otros métodos químicos (12; 13), capaz de introducir ADN de todas las tallas desde oligonucleótidos de cromosomas de levadura (40), introducción de ARN (46) y proteínas (14). A diferencia de los otros métodos químicos puede ser usado para transferir ADN y ARN in vivo a humanos y animales (18; 45).

En el año 1980, Fraley et al. (21), comenzaron a utilizar liposomas artificiales para introducir ADN en el interior de las células, ya en la actualidad existe un gran número de lípidos que se emplean en este método.

Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación de cargas entre el lípido y el ADN, la cantidad de ADN empleado, el tiempo que se exponen las células la complejo y la presencia o ausencia de suero (5).

Métodos físicos de transfección celular: Son aquellos en los que se produce una introducción mecánica del ADN como la microinyección (60), electroporación (33; 48), fusión de protoplastos (58) y bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN (41; 42).

a) Microinyección directa:

Esta técnica resulta ser muy efectiva, para la transfección celular, aunque laboriosa. Básicamente, se usa como un método para establecer líneas celulares que lleven copias integradas del ADN de interés. Es además, el método que se emplea en la introducción del ADN recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos (60).

Tiene como ventajas que no se exponen los polinucleótidos a los compartimentos celulares, tales como el endosoma (de bajo pH), es un método simple, económico, y no tóxico para las células, puede ser usado tanto en ensayos de transfección estables como transitorios, lográndose una alta eficiencia, donde una de cada cinco células incorporan el ADN de forma estable. Sin embargo, no puede ser empleado de forma rutinaria para introducir ADN a un gran número de células, como para permitir después análisis bioquímicos, y requiere de equipamientos, infraestructura y personal altamente entrenado (60).

b) Electroporación:

Es una técnica de introducción de ADN a células en cultivo que fue reportada por primera vez, por Wong y Neumann (83), para estudios de transfección de

genes. Se realiza mediante la aplicación de pulsos eléctricos a las células, lo que provoca la apertura de poros en la membrana de estas con la consiguiente penetración del ADN presente en el medio de electroporación. Conlleva a la formación de líneas celulares establemente transformadas con la integración de una sola copia del ADN foráneo (59; 67).

Las ventajas de esta técnica son que permite la transfección de líneas celulares recalcitrantes a otros métodos (se requiere de su optimización para cada tipo celular), se aplica a millones de células a la vez y habitualmente la eficiencia de transfección celular es del 100% de las células que sobreviven al pulso eléctrico.

En términos generales la mayor desventaja de la electroporación es su costo, ya que la mayoría de los equipos comercialmente disponibles son caros, en el orden de los miles de dólares, además de los accesorios como cubetas y adaptadores que también lo son (7).

La eficiencia de la transfección por electroporación está influenciada por una serie de factores, que necesitan ser optimizados para lograr los resultados deseados (7), entre estos se encuentran: la magnitud del campo eléctrico aplicado; la duración del pulso eléctrico; temperatura; concentración, pureza y tipo de ADN; y composición iónica del medio.

Ha sido utilizada para introducir ADN en una amplia variedad de células de animales (83), de plantas (22) y también de bacterias y levaduras (1), en la introducción de ADN foráneo a espermatozoides bovinos para su uso en transgénesis mediada por inseminación artificial (23) y transfección de células embrionarias totipotentes (30). Además, se ha adaptado como una herramienta para un amplio rango de investigaciones biomédicas y terapia humana, fundamentalmente en investigaciones y tratamiento del cáncer (25; 35; 44).

Recientemente, Haleem-Smith et al. (33) optimizaron una nueva variación de esta técnica llamada Nucleofección, donde el ADN plasmídico es transferido directamente en el interior del núcleo celular, independientemente del estado de crecimiento de la célula. Esta técnica muestra una alta eficiencia de transfección y una aceptable supervivencia celular, lo que la hace útil en estudios de expresión de genes en biología cardiovascular, y como paso hacia el desarrollo de las estrategias de terapia del gene (36).

c) Fusión de protoplastos:

Desarrollado por Schaffner en 1980 (66), el método consiste en obtener protoplastos de bacterias que llevan alto número de copias del plásmido de interés y se funde directamente con las células de mamíferos en cultivo.

A pesar de no ser de los métodos más eficientes para las líneas celulares normalmente usadas en los laboratorios, se ha utilizado tanto en transfecciones transitorias como estables, fundamentalmente, para aquellas líneas celulares en las cuales el proceso de endocitosis ocurre de forma ineficiente.

La gran ventaja del método radica en su eficiencia para ciertos tipos celulares, mientras que su desventaja es la gran cantidad de manipulaciones que conlleva, el tiempo de trabajo y que normalmente no son posibles las cotransfecciones, por lo que el gen de interés tiene que estar siempre contenido en un plásmido junto con el marcador de selección (65).

d) Bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN:

Este método de transfección celular consiste en la introducción del ADN adherido a micropartículas que se disparan a alta velocidad sobre las células (84). Ha sido utilizado de forma satisfactoria para introducir ácido nucleico a las células en cultivo de igual forma que ocurre in vivo (38).

El primer reporte de transfección de células de mamíferos empleando microproyectiles fue publicado por Zelenin et al. (86), al introducir el gen de la resistencia a neomicina en fibroblastos NIH/3T3. Otros reportes han aparecido en los últimos años que incluyen la transfección de ovocitos de peces (39), células humanas, fibroblastos de pollo, miotúbulos esqueléticos, células epiteliales y miocardiocitos (37). Recientemente, también se adaptó la metodología para células en suspensión, y se ha logrado transfectar células linfoides humanas (43).

Este se ha mostrado como un método efectivo de transferir genes tanto in vitro como in vivo (41; 42). Sin embargo, características de rigidez de los diferentes tejidos, la procedencia del ADN extraño, y la capacidad de transcripción intrínseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia de la expresión de los genes en conjunto. Esto podría sugerir aplicaciones limitadas de esta tecnología en la terapia génica, pero sería útil para investigaciones en la expresión de construcciones de ADN en tejidos específicos.

Finalmente, un desarrollo factible de este método puede ser aplicado en su uso directo como parte de un protocolo de vacunación, como demuestran las investigaciones de Ulmer et al. (78), al realizar la inyección directa en el músculo, del gen que codifica la proteína de matriz del virus influenza A.

A pesar de lo avances alcanzados, la biobalística no es utilizada como una técnica de rutina, por su carestía, las dificultades para su aplicación y la existencia de otros métodos mucho mas simples y costeables.

e) Fotoporación laser-asistido:

Recientemente, se ha reportado el método de fotoporación láser-asistido (50; 71; 72) utilizando fuentes como la agitación continua de los lásers del argón-ion que funcionan a 488 nm (54; 68; 69), y más recientemente con los lasers del titanio-zafiro del femtosecond (76; 77; 85).

Consiste en la utilización de un rayo láser firmemente enfocado (con un volumen focal localizado de ~10-19 m3), que perfora la membrana celular, permitiendo que las moléculas se incorporen a la célula. La fluidez de la membrana facilita el cierre subsiguiente de la perforación.

A pesar de que las pruebas con los métodos de fotoporación han resultado satisfactorias, los sistemas del láser empleados son relativamente incómodos e implican típicamente procesos de dos fotones, los cuales requieren la colocación extremadamente exacta del foco del láser en la membrana celular. Tales técnicas han demostrado ser relativamente difíciles de alcanzar.

Como alternativa, más directa los procesos de un fotón han recibido menos atención en la literatura debido a los efectos potencialmente perjudiciales sobre la célula apuntada. Realizando la técnica con suficiente cuidado y control del rayo láser incidente, se ha demostrado un avance dominante en este campo, empleando un sistema altamente compacto y barato del láser. Al formar los poros en la membrana celular utilizando la vía de un solo fotón se logra una alta eficiencia y se evitan los daños celulares. Las células individuales transfectadas pueden mantener su capacidad de multiplicación en forma de clones que son utilizados para crear líneas celulares estables (69).

Una variante más reciente de este método es la transfección de células por el método de fotoporación con un láser de diodo violeta (57). Esta variante es fácil de poner en ejecución, particularmente si existe un microscopio óptico disponible, pues la fuente de láser es barata, compacta y portátil, en comparación con las fuentes previamente usadas para el fotoporador de láser. Las células se pueden seleccionar visualmente apuntado por el fotoporador, y utilizando valores bajos de energía en un corto periodo de tiempo, no causan daños irreversibles de la membrana de la célula.

8. EL MICROSCOPIO

RESEÑA HISTORICA

Se inventó el microscopio cerca de los comienzos del 1600, por un ya conocido personaje llamado Galileo Galilei (Pisa, 15 de febrero de 1564 - Florencia, 8 de enero de 1642), fue un astrónomo, filósofo, matemático y físico italiano que estuvo relacionado estrechamente con la revolución científica; aunque los holandeses afirman que el inventor fue Zacharias Janssen nació en Middelburg, en los Países Bajos, en 1588 y murió en esa misma ciudad en 1638.1 Provenía de una familia que fabricaba lentes. Su padre fue Hans Janssen. Aunque el origen del microscopio es una cuestión aún incierta, se le considera como el inventor del microscopio compuesto (con dos lentes), tal vez con la ayuda de su padre, en el año 1595.

La palabra microscopio se usó por primera vez por un grupo denominado Academia dei Lincei, ésta era una sociedad científica a la que Galileo pertenecía, estos científicos realizaron sus primeras observaciones con un microscopio. Las primeras publicaciones importantes dentro del campo de la microscopía se realizaron entre 1660 y 1665 cuando se prueba la teoría Harvey sobre la circulación sanguínea al observar en el microscopio los capilares sanguíneos.

En 1665, Robert Hooke hizo una observación con el microscopio de un delgado corte de corcho y pudo notar la porosidad del material; dichos poros, en conjunto, formaban cavidades que eran poco profundas a modo de cajas, a las mismas las llamó células. Lo que había observado Hooke era células muertas. Un tiempo más tarde, Marcelo Malpighi, un reconocido anatomista y biólogo italiano, pudo observar células vivas y fue el primer encargado de estudiar tejidos vivos en el microscopio.

En 1931 fue desarrollado en Alemania por Max knoll y Ernst Ruska el microscopio electrónico de transmisión electrónico desarrollado, no daba imágenes superiores a las de luz existente en aquel momento.

NORMAS PARA EL CUIDADO DEL MICROSCOPIO

1. Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre las dos manos, sujetándolo por el brazo con una mano y por el pie con la palma de la otra.

2. Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe moverse hasta que finalice la práctica. Cuando se vaya a cambiar de observador se debe mover él y no el microscopio.

3. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del microscopio.

4. Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del objetivo. Si se ensucian las lentes se limpiarán con paño suave de algodón sin disolvente.

5. No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que vayan a ser sustituidos, en cuyo caso la operación debe realizarse lo más rápidamente posible, para evitar la entrada de polvo.

6. Asegurarse de que el portaobjetos está bien seco cuando va a ser colocado sobre la platina.

7. Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor aumento, hay que evitar que el extremo del objetivo choque con la preparación. Para ello acercaremos el objetivo a la preparación mirando lateralmente y luego, mirando ya a través del ocular, enfocamos alejando el objetivo.

8. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma.

9. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes .si no se va usar de forma prolongada, se debe guardar en un sitio que se pueda proteger del polvo.

10. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de óptica.

11. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

12. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para ópticas o de papel de óptica. En cualquier caso se pasara el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con xilol no hay que abusar de este tipo de limpieza porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar la lentes y su sujeción.

13. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina revólver y condensador).

14. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

15. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido secarlo con un paño.

16. Guarde el microscopio en el objetivo de baja potencia en el punto más alejado de la platina y sin que los bordes de están

ESQUEMA DEL MICROSCOPIO Y SUS PARTES

• OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

• OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

• CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

• DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

• FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

• SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

• PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

• CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.

• REVOLVER: Contiene los sistemas de lentes oculares. puede ser monocular, binocular.

• TORNILLOS DE ENFOQUE: Micrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

AGRUPACION DE LOS COMPONENTES DEL MICROSCOPIO

SISTEMA LUMINOSO O DE ILUMINACION: Consta de tres estructuras: espejo o lámpara, que refleja o produce la luz; diafragma, que regula la cantidad de luz; condensador, cuya función consiste en concentrar los rayos luminosos hacia la muestra.

Sus componentes emiten la luz para permitir la observación del objeto. En un microscopio compuesto la fuente luminosa puede ser un espejo que concentre los rayos de luz solar; o como ocurre en los microscopios compuestos más modernos, se emplea una ampolleta.

EL SISTEMA SOPORTE. Es la estructura que sostiene las demás partes del microscopio y le permite moverse. Está formado por el tubo, la platina y el pie. El tubo contiene en su extremo superior el ocular, y a través de él la luz llega hasta el lente objetivo; la platina es donde se coloca la muestra que se va a observar; y el pie es la estructura sobre la que se apoya el microscopio.

En el mecánico se incluyen dos tornillos que facilitan el enfoque del objeto observado: el tornillo micrométrico (permite el enfoque global de la muestra) y el tornillo micrométrico (enfoca detalladamente y con precisión cada una de sus partes). Por tanto este sistema de soporte y mecánico del microscopio está compuesto por: tubo del ocular, revólver, platina, pinzas, brazo, base, tornillos macrométrico y micrométrico.

Conjuntamente se encargan de amplificar la imagen de las estructuras y organismos. El ocular y los objetivos están marcados con unos números que indican el aumento de cada lente. Si multiplicamos estos números, se conoce el aumento total con el cual estamos observando

SISTEMA DE AUMENTO. Sus estructuras participan en el proceso de formación de la imagen y son conocidos como lentes ópticos. Existen tres tipos de lentes: ocular, objetivo y condensador. El ocular y el objetivo participan directamente en la formación de una imagen de mayor tamaño que la del objeto observado. Existen además varios lentes objetivos, cada uno con diferente aumento, que se ubican en una estructura llamada revólver. El condensador es otro tipo de lente, pero su función es diferente: concentra la luz en el mismo plano del objeto, de manera que permite una correcta iluminación asegurando una imagen nítida y clara.

El aumento total puede calcularse con sólo multiplicar el aumento del objetivo por el del ocular. En los microscopios compuestos éste alcanza una 1000 veces, y se obtiene al multiplicar el aumento del lente ocular (10) por el aumento del lente objetivo (100).

SISTEMA DE AJUSTE O PARTE MECÁNICA DEL MICROSCOPIO

La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

PARTES DEL MICROSCOPIO

TIPOS DE MICROSCOPIO

Microscopios ópticos

• La fuente de iluminación es la luz.

• De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastado mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.

• De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.

• De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.

• De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en relieve de las mismas.

• De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadida a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

• Confocal. Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es un microscopio computarizado que acopla un láser a un microscopio óptico obteniéndose imágenes fluorescentes. Análisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especial llamado pinhole que elimina la señal de las regiones que se encuentran fuera de foco.

Microscopios electrónicos

• La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes.

• De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.

• De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro.

• La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de aumentos y en el límite de resolución (LR).

• El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y la lente Ocular.

• El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben encontrar dos puntos para que puedan observarse separados. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo.

• Si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio se debe incrementar el número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Normalmente se utiliza aceite de inmersión. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite.

Microscopio petrográfico

El microscopio petrográfico o de polarización se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de las rocas ígneas y las rocas metamórficas. Cuenta con un prisma de Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a través del espécimen examinado (véase Óptica: Polarización de la luz). Otro prisma Nicol o analizador que determina la polarización de la luz que ha pasado a través del espécimen. El microscopio tiene un soporte giratorio que indica el cambio de polarización acusado por el espécimen.

Microscopio en campo oscuro

Debido al ángulo de incidencia del haz luminoso sobre el espécimen que se va a observar, permite que el fondo sea oscuro y los bordes de las células sanguíneas aparezcan brillantes. Esto es posible gracias al tipo de condensador que lleva este tipo de microscopio. La luz se dispersa al chocar contra la célula o espécimen que se va a observar. Es como si en una habitación oscura entra un pequeño haz de luz por una rendija de una ventana y en el fondo oscuro de la habitación se iluminan las partículas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible. Para comprender como funciona la microscopía en campo oscuro hemos puesto un video que nos hace visualizar este tipo de técnica.

Microscopio de fase electrónico

En 1932, Bruche y Johnsson construyeron el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Este, utiliza un flujo de electrones en lugar de luz, consta fundamentalmente de un "tubo de rayos catódicos", en el cual debe mantenerse el "vacío".

Los aumentos máximos conseguidos son del orden de 2.000.000 (dos millones) de aumento. Este microscopio consta de:

• Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones.

• Condensador o lente electromagnético que concentra el haz de electrones.

• Objetivo o lente electromagnético que amplía el cono de proyección del haz de luz.

• Ocular o lente electromagnético que aumenta la imagen.

• Protector que amplía la imagen.

• Pantalla fluorescente que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.

Tipos de microscopio electrónico:

• Microscopio electrónico de transmisión

• Microscopio eléctrico de barrido

• Microscopio eléctrico mixto

Con estos poderosos instrumentos, que utilizan flujo de electrones y las radiaciones magnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas se han logrado grandes avances en la biología celular.

PAUTAS DE MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de10 Aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

• Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

• Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión:

• Bajar totalmente la platina.

• Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

• Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.

• Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

• Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

• Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

• Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

• Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

• Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.

• Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

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