Superantígenos Inducen La Apoptosis De células T Neoplásicas

Introducción

El linfoma se desarrolla en un proceso de varias etapas en el que las lesiones genéticas acumuladas promueven la proliferación y/o supervivencia de las células diana que con el tiempo generan un clon maligno autónomo. Tanto la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores están implicados en el desarrollo de linfomas tímicos murinos. Aunque las aberraciones genéticas específicas varían dependiendo del agente etiológico, linfomas tímicos se desarrollan después de un relativamente largo período de latencia y consisten de expansiones mono o oligoclonales que indican que los clones preneoplásicos raros se seleccionan para completar el proceso de transformación. Los factores epigenéticos también pueden desempeñar un papel en la selección de las células preneoplásicas para la progresión del tumor. Por ejemplo, se ha propuesto que el antígeno viral mediado por la unión de TCR en las células diana activa una vía de señalización mitogénica que promueve linfogénesis inducida por retrovirus. Alternativamente, las señales no mitogénicas inducidos por las interacciones TCR-ligando pueden operar en los clones preneoplásicos en un proceso análogo a los eventos de selección positivos y negativos que se producen durante el desarrollo de células T normales. En consonancia con esta idea, se informó que la selección negativa debe influir en el desarrollo de linfoma del timo en ratones transgénicos macho.

Los superantígenos (Sags) son proteínas bacterianas y virales que comparten la capacidad de activar un gran número de células T normales. Los Sags se unen al complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII), como proteínas sin previo procesamiento y, posteriormente, interactúan con un alto número de células T que expresan receptores de células T (TCR) con cadenas Vβ. Después de varios ciclos de proliferación, células T que son reactivas a los Sag son sometidas a apoptosis o sufren anergia.

Superantígenos bacterianos son una familia bien descripta de toxinas secretadas y producidas principalmente por Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. La capacidad de los Sags bacterianos para inducir la activación y la supresión de las células T, que expresan receptores de células T (TCR) con regiones específicas cadenas variables β(Vβ) en ratones se ha estudiado ampliamente. Por ejemplo, en ratones, las enterotoxinas estafilocócicas (SEs) A y E se unen a receptores de células T que llevan cadenas Vβ 3 , 7 , y 17 , aunque con diferente avidez. Las enterotoxinas estafilocócicas SEB y sus relativos, SEC 1-3, comparten reactividad con las células T con la familia de cadenas Vβ 3, 7 y 8,1-3. Recientemente hemos descrito que la enterotoxina SEI estimula significativamente las células T de ratón que llevan cadenas Vβ 3, 5 y 13.

El virus del tumor mamario de ratón (MMTV) es un retrovirus tipo B que induce adenocarcinomas mamarios en ratones. MMTV tiene dos vías de infección en ratones: hay cepas susceptibles a adquirir el virus a través de la leche (transmitidas por infección), mientras que otras cepas heredan copias del provirus endógenos (MTV). Los MTVS están presentes en la línea germinal de la mayoría de los ratones consanguíneos y hay múltiples secuencias provirales que se encuentran en diferentes localizaciones cromosómicas, en las diferentes cepas de ratón.

Aunque la mayoría de estas secuencias endógenas provirales no producen partículas virales debido a mutaciones en sus regiones reguladoras o de codificación, todos ellos expresan un superantígeno que está codificado en su región LTR. Diferentes provirus endógenos y exógenos provocan la eliminación de diferentes clases de células T portadoras de cadenas Vβ, debido a que codifican para proteínas Sag con diferentes secuencias de aminoácidos C-terminales. Existen dos variantes de MMTVs exógenos, denominado MMTV BALB14 y MMTV BALB2. El primero codifica para un Sag que se reconoce específicamente por las células T que llevan la región Vβ14 ; MMTV BALB2 codifica para una Sag que entra en contacto con células T Vβ2+.

Superantígenos y superantígenos direccionados (targeted) se han utilizado para potenciar la inmunogenicidad de las células tumorales murinas y humanas en diferentes modelos experimentales, sobre todo mediante la fusión de la región Fab de anticuerpos monoclonales reactivos con el tumor mutado en SEA o en SEB (enterotoxinas). Sin embargo, no ha habido intentos de investigar la capacidad de los superantígenos para inducir la apoptosis en las células T neoplásicas utilizando señalización a través de la zona Vβ de su TCR.

En el presente trabajo demostraremos que el virus MMTV codificado, así como los superantígenos bacterianos son capaces de inducir, tanto in vitro como in vivo, la apoptosis de las células T que expresan cadenas TCR Vβ en linfomas de ratones AKR/J. Sorprendentemente, se demuestra que la exposición in vivo a superantígenos es capaz de mejorar significativamente la supervivencia de ratones portadores de linfoma de células T.

Materiales y Métodos

Ratones y linfomas

Ratones AKR/J macho y hembra se mantuvieron sin tratamiento hasta que desarrollaron linfomas de células T espontáneos con más 6 meses de edad. Los ratones fueron sacrificados cuando la ampliación del timo era evidente. Ratones AKR/J de uno a 3 meses de edad, macho y hembra, se utilizaron como huéspedes de células de linfoma compatibles de sexo, o como donantes de esplenocitos o macrófagos. Ratones AKR/J de 2 a 14 meses de edad sin aumento de timo ni un repertorio TCRVβ dañificado fueron utilizados para determinar el nivel de expresión de Fas, Fas-L y moléculas Bcl-2 en timocitos por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS – Fluorescence-activated cell sorting).

Los linfomas se caracterizan por FACS con el fin de determinar la expresión de CD4, CD8, la cadena de TCRβ y la región Vβ, Fas, Fas-L y Bcl-2. Las células de linfoma fueron inyectadas intraperitonealmente en ratones AKR/J. Todos los linfomas mantuvieron su fenotipo. Cuatro linfomas T que expresan la región Vβ en más del 95% de las células fueron elegidos para investigar su reactividad frente a Sags: 1)T14, teniendo la región Vβ14 y expresando ambas moléculas CD4 y CD8 ; 2) T8, reactivo para el anticuerpo monoclonal anti-Vβ8 y expresando ambas moléculas CD4 y CD8, 3)T8.2, reactivo para el Anticuerpo monoclonal anti- Vβ8.1 , 8.2, y expresando CD4 y 4)T5, un linfoma CD4+ que expresa la región Vβ5 .

Anticuerpos monoclonales:

Los siguientes AcMo conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o Citocromo 5 se utilizaron para el análisis FACS: anti-CD4 (clon H129.19); anti-CD8a (clon 53 - 6.7), anti-TCRβ (clon H57-597), anti-Vβ14 (clon 14-2), anti-Vβ17a (clon KJ23), anti-Vβ13 (clon MR12-3), anti-Vβ12 (clon MR11-1), anti-Vβ11 (clon RR3-15), anti-Vβ10b (clon B21.5), anti-Vβ9 (MR10-2), anti-Vβ8.3 (clon 1B3.3), anti-Vβ8.1, 8.2 (clon MR5-2), anti-Vβ7 (clon TR310), anti-Vβ6 (clon RR4-7), anti-Vβ5.1, 5.2 (clon MR9-4), anti-Vβ4 (clon KT4), anti-Vβ3 (clon KJ25) o anti-Vβ2 (clon B20.6), anti-Fas (CD95 clon Jo2) y anti-Fas-L (CD178, clon MFL3). La tinción intracelular de Bcl-2 se realizó con FITC o PE-conjugado anti-Bcl-2 (clon 3F11) y el kit Cytofix/Cytoperm.

Tinción de citometría de flujo

Para la tinción doble o triple, 16.106 células fueron incubadas con los AcMo apropiados como se describe anteriormente. La adquisición de 30.000 células se realizó utilizando un citómetro de flujo FACScan. Los resultados se analizaron utilizando el software Cell Quest.

Toxinas e infección con MMTV

Se adquirieron las toxinas purificadas, enterotoxina estafilocócica B (SEB), E (SEE) y la enterotoxina estafilocócica I (SEI). Las toxinas se diluyeron en PBS y se mantuvieron congeladas en soluciones a -20ºC hasta su uso. Ratones AKR/J fueron infectados con el MMTV BALB2 o MMTV BALB14 por inyección, en la almohadilla de la pata, de 50ml de leche que contenía el virus. Ratones control no infectados recibieron la misma inyección, en la almohadilla de la pata, con 50 ml de leche libre de virus.

Cultivos

Diferentes números de células de linfoma fueron co-cultivadas con esplenocitos de ratones AKR/J MMTV, infectados o no infectados, previamente tratados con mitomicina-C. Alternativamente, las células del linfoma fueron co-cultivadas con macrófagos intra-peritoneales obtenidos a partir de ratones AKR/J que habían recibido inyección de tio-glicolato, en la presencia de 10 µg/ml de SEB, SEE, SEI o PBS. Todos los cultivos se realizaron en 96 pocillos de fondo plano de placas de microcultivo en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% de antibiótico-antimicótico y 50 µM de 2-mercaptoetanol y se incubaron en atmósfera de CO2 al 5% humidificado a 37ºC.

Ensayos de proliferación

La respuesta proliferativa in vitro de células de linfoma frente a los superantígenos se determinó mediante la incorporación de 3H-timidina en el ADN. Las células de linfoma fueron co-cultivadas con esplenocitos infectados con MMTV o con macrófagos expuestos a Sags bacterianos. A las 24 horas de cultivo, las células recibieron 1µCi de 3H-timidina y 18 horas más tarde se recogieron en un filtro de fibra de vidrio. Las muestras se contaron en un Beta-contador de centello.

Además, las células del linfoma fueron etiquetadas utilizando 5,6 carboxi-fluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) y se cultivaron con Sags. Después de 48 horas, se recuperaron las células y la proliferación se analizó por dilución de CFSE.

Para los ensayos de proliferación in vivo, las

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