Sustratos Y Medios De Cultivo

PROTOCOLO 8,1. PREPARACIÓN DE MATRICES EXTRACELULARES (La matriz extracelular (MEC) es diseñada y producida por las células residentes de cada tejido y órgano, encontrándose en un estado de equilibrio dinámico con su entorno (9). La estructura y función molecular de la MEC proporciona los medios por los cuales las células adyacentes se comunican entre ellas y con el ambiente externo (10). Además, proporciona un medio de soporte para nervios, vasos sanguíneos y linfáticos, y para la difusión de nutrientes (9). No se ha caracterizado completamente la compleja organización tridimensional de la estructura y función molecular que compone la MEC, haciendo imposible la síntesis de este biomaterial en el laboratorio (11). Se han usado varias formas de MEC como matrices biológicas para promover la remodelación de tejidos y órganos, incluyendo piel, intestino, hígado y páncreas, entre otros tejidos (9). Muchas de estas MEC se han comercializado para aplicaciones terapéuticas variadas.

También existe gran variedad de formas para obtener la MEC de los tejidos y eliminar el contenido celular (9). La remoción de componentes antigénicos asociados con las membranas celulares y componentes intracelulares de órganos y tejidos es fundamental para disminuir o evitar una respuesta inmunológica adversa (9).

El principal objetivo de cualquier protocolo de descelularización es remover todo el material celular sin afectar la composición, integridad mecánica y actividad biológica de la MEC remanente (9). Después de eliminar el contenido celular mediante alguno de los métodos utilizados (sonificación, agitación, congelación y descongelación), se realiza un enjuague y remoción de las células remanentes en la MEC (11). Algunos detergentes usados en este proceso pueden dañar el colágeno, alterando las propiedades mecánicas de la MEC (12). L

PREPARACIÓN DE ECM

Eliminar una monocapa de células formadoras de la matriz de células con detergente, lavar frasco o plato, y las células requeridas en la matriz residual.

Materiales

Fibroblastos de ratón, por ejemplo, 3T3, MRC-5 humanos fibroblastos, o células endoteliales de la arteria pulmonar de bovino (o cualquier otra línea celular mostrada ser adecuada para la producción de la matriz extracelular)

agua ultrapura (UPW) (véase la sección 11.4.1)

Triton X-100, 1% en agua ultrapura.

protocolo

1. Configurar matriz productoras de cultivos, y dejar crecer hasta confluencia

2. Después de 3-5 días de la confluencia, se elimina el medio y añadir un volumen igual de Triton estéril 1% X-100 en agua ultrapura a la monocapa celular.

3. Incubar durante 30 min a 37 ◦ C.

4. Retire la solución de Triton X-100 solución y lavar los residuos tres veces con el mismo volumen de agua ultrapura estéril.

5. Frascos o platos puede ser utilizado directamente o puede ser almacenados a 4 ◦ C durante un máximo de 3 semanas.

Capas alimentadoras

Aunque recubrimiento de una matriz puede ayudar a la fijación, crecimiento, y la diferenciación celular, algunos cultivos de células más exigentes, especialmente en bajas densidades celulares [Puck y Marcus, 1955], requerirá el apoyo de las células vivas (por ejemplo, fibroblastos de embrión de ratón; véase el Protocolo 13,3).

Esta acción se debe parcialmente a la suplementación del medio ya sea por fugas metabolito o la secreción de factores de crecimiento de los fibroblastos, pero También puede ser debido al acondicionamiento del sustrato por células productos. Las capas Alimentadoras cultivadas en monocapa confluente puede hacer la superficie adecuada, o incluso selectiva, para la fijación por otras células. La supervivencia y la extensión de neuritas por el centro y las neuronas periféricas se puede mejorar mediante el cultivo de las neuronas sobre una monocapa de células gliales, aunque en este caso el efecto puede ser debido a un factor difusible en lugar de contacto celular directo.

Después de que un cultivo en monocapa alcanza la confluencia, subsiguiente proliferación hace que las células de separar del sustrato artificial y migrar sobre la superficie de las monocapas. La morfología de las células puede cambiar (fig. 8.12): Las células puede llegar a ser menos extendido, más densamente teñido, y más altamente diferenciados. Al parecer, y no es demasiado sorprendente que el interacción de una célula con una capa base celular es diferente de la interacción de la célula con un sustrato

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