Medios De Cultivos

Enbiología, y específicamente enmicrobiología,un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos como bacterias, hongos y parásitos, en el que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado como un método fundamental para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades

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.Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de una ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.

La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de estemodo, el estudio, caracterización, aplicacion ycontrol de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos: 1. Disponibilidad de nutrientes 2. Consistencia adecuada del medio 3. Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases. 4. Condiciones adecuadas de humedad 5.Luzambiental 6.pHadecuado 7.Temperatura 8.Esterilidad.Si las condiciones se cumplen, se podrán realizar observaciones de manera eficiente

CULTIVOS DE MICROORGANISMOS

MEDIOS DE CULTIVO

De manera general se denomina “medio de cultivo” a cualquier material que presente una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el aumento del número de células de una población microbiana. En los laboratorios de microbiología se utiliza una gran variedad de medios de cultivo para mantener cepas, aislar o identificar microorganismos responsables de la contaminación de alimentos, medicamentos o cosméticos, aislar o identificar microorganismos con el propósito de diagnosticar alguna enfermedad, preparar cultivos masivos de microorganismos para la elaboración de vacunas bacterianas, etc.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS

MEDIOS GENERALES

No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero si contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.

MEDIOS SELECTIVOS

Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el aislamiento de patógenos entéricos.

MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES

A veces se combinan en un mismo medio las características de ser selectivo y diferencial. Por ejemplo, el agar McConkey, este medio contiene sales biliares y cristal violeta, que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas. Pero como también contiene lactosa y un indicador de pH permite distinguir entre las bacterias fermentadoras de lactosa y las que no lo son.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO

Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).

TEMPERATURA

Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural.

Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo humano.

pH

El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7, 5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.

OXÍGENO

La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina

aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Conocer las técnicas de siembra y las condiciones para el crecimiento las bacterias.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Aprender las técnicas de preparación de diferentes métodos de siembra.

Aprender a inocular distintos medios de cultivos contenidos en caja petri.

MARCO TEORICO

La siembra microbiológica es un procedimiento mediante el cual se deposita (siembra) asépticamente un microorganismo en un medio de cultivo. En ellos los microorganismos se multiplicarán produciendo millones de descendientes que formarán unidades macroscópicamente visibles denominadas colonias. El material que contienen los microorganismos que se van a sembrar recibe el nombre de inoculo y este proceso se puede realizar mediante un filamento metálico, que recibe el nombre de asa de cultivo. Siembra por estrías o diseminación (Pentágono) y zigzag consiste en pasar el asa de cultivo con el inoculo sobre la superficie de una placa Petri que contiene el medio de cultivo adecuado para la bacteria que se desea cultivar. Al pasar el asa, haciendo estrías unas separadas de otras, se logra que el inóculo se diluya progresivamente de forma tal que al final de las estrías se obtienen colonias aisladas. En medios sólidos el crecimiento bacteriano se evidencia por la formación de colonias, las cuales pueden presentar entre otras las siguientes características:

Tamaño.- grandes o pequeñas.

Forma.- circular, Irregular, Rizoide, filamentosa

Superficie:-plana, meseta, convexa, umbilicada.

Consistencia.- seca u opaca, húmeda o brillante, Butirosa (mantequilla)

mucosa quebradiza, membranosa.

Pigmento.-pueden o no presentar pigmento, el cual puede estar circunscrito a la colonia (endopigmento) o bien difundir al medio (exopigmento).

Olor.- amoniacal, fecaloideo, dulzón etc.

Hemólisis.- está relacionado con la destrucción de los glóbulos rojos.

Cuadro No 1

PROCEDIMIENTO

* El primer paso es preparar la zona estéril y abrir los medios de cultivo al lado de la estufa.

* Tomamos la muestra y procedimos a sembrar.

METODO POR ESTRIA EN MEDIO SOLIDO EN CAJA PETRI

1. El asa de siembra en anillo debe ser esterilizada en la llama (flameada al rojo), manteniéndola verticalmente en el mechero y enfriarla.

2. Tomar con el asa de siembra en anillo una cantidad suficiente de muestra (o con el hisopo de madera)

3. Con la mano izquierda se toma la placa petri de agar, se manipula con los dedos para levantar parcialmente la tapa.

4. Con la mano derecha se toma el asa sosteniéndola suavemente entre los dedos con cuidado de no hundirla en el medio. Se distribuye la muestra (inoculo) por estrías en zigzag, con escasa separación unas a otras (1 a 3 mm) en el medio solido en caja petri, dividido en cuatro cuadrantes, inoculando la muestra en cantidades menores en cada cuadrante.

5. El numero de estrías depende de la cantidad de inoculo y los planos de siembra ensayados (1,2 o 4 planos o cuadrantes). Se debe evitar romper el medio

6. Esterilizar el asa de siembra a la llama y enfriarla

7. Rotular la caja petri con el plumón indeleble

8. Incubar la caja petri con la muestra en la incubadora microbiológica a 37°C por 24 horas. En este caso no se pudo utilizar este procedimiento debido a que en el laboratorio carece de una incubadora.

9. Al día siguiente observar las cajas petri con la estufa prendida, observando que en cada cuadrante se presentara diferente distribución de colonias.

Figura No 1

EL MÉTODO DE SIEMBRA POR ESTRÍA EN CAJA.

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una caja Petri (a las caja Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo

que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera caja. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

Análisis de resultados:

En la caja de petri del AGAR NUTRITIVO se observa que hay un posible crecimiento de bacterias, en nuestro resultado se pudo observar las siguientes características:

- Su estructura no es totalmente lisa

- Su coloración es blanca

- Su borde es lobulado

- Su olor es fétido

- Sus líneas son gruesa en forma irregular

- En este cultivo no se encuentran colonias.

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En el AGAR OXYTETRACYLINE en esta siembra donde se puede observar su forma como se hizo inicialmente, en estria con unas características como:

- Coloración blanca y en el extremo izquierdo-superior se encuentra un color amarillento

- Con forma irregular

- Sus líneas son gruesas

- Con olor fétido.

- Su superficie es rugosa

- Tiene crecimiento de colonias, con una cantidad de 40 colonias aproximadamente.

En el agar MacConkey se utilizo método de zigzag donde se observo en la parte superior-derecha una pequeña línea en forma similar a basilos corineformes con coloración blanca donde no se presenta formacion de colonias, pero si se encuentra crecimiento microbiano.

EL AGAR EOSIN se observo el crecimiento de una de solo una colonia con forma filamentosa con borde entero y con coloración blanca y se encuentra ubicada en el medio del lado izquierdo de la caja petri.

EL AGAR PLATE COUNT

En esta siembra se lleno por completo la caja petri de crecimiento de microorganismos excepto en la parte superior-izquierda donde quedaron 4 pequeños espacios con ausencia de microorganismos por el cual no se puede observar su método de siembra (zig-zag) y tampoco se presento formación de colonias. Con una coloración blanca y olor fétido.

IDENTIFICACIÓN:

El AGAR OXITETRACICLINA tiene por finalidad aportar vitaminas para el crecimiento de muchos hongos; la oxitetraciclina actúa como agente selectivo, impidiendo el crecimiento bacteriano, actúa como factor limitante del crecimiento en diámetro de las colonias de hongos invasores de crecimiento rápido, principalmente Zygomycetos (Rhizopus, Mucor, Absidia, etc.), que podrían cubrir por completo la superficie del Agar y dificultar, alterar o impedir, incluso el recuento. En este cultivo se da amarilla aunque también se puede dar blanca, doradas en este caso fue por crecimiento de la famila Micrococcaceae de género Micrococcus

El AGAR NUTRITIVO es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. Donde se presenta el crecimiento de P. mirabilis, E coli, S aureus, E faecalis, P aeruginosa.

En el AGAR MACCONKEY en este medio crecen los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae . El crecimiento microbiano se presento gracias al aporte de las peptonas que aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento de estas bacterias.

En el AGAR EOSIN es un medio selectivo que permite el crecimiento de bacilos gramnegativos, principalmente de la Familia Enterobacteriaceae, inhibiendo el crecimiento de las bacterias grampositivas. También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración de las colonias si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira dando lugar a la aparición de colonias oscuras, de color rosado a verde brillante (Ej: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter). Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras o

transparentes (Ej: Salmonella, Proteus, Pseudomonas).

En el AGAR PLATE ACOUNT es un medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas bacilos gran negativos de rápido desarrollo y escasa exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas especies de la familia Enterobacteriaceae También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas.

Discusión:

CONCLUSIÓN

Todos los microorganismos viven y se multiplican gracias a substratos nutritivos que se encuentran en el medio ambiente de forma natural.

Nosotros podemos reproducir dichas condiciones en el laboratorio, a fin de observar la presencia, ausencia o comportamiento de determinados microorganismos. Este método de análisis se llama "medios de cultivo" y es en estos medios donde se "siembran bacterias" con que fin de estudiar morfológicamente las colonias. Las técnicas de siembra e Inoculaciones o siembras.

Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.

Bibliografía:

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2. Brooks Geo F. Microbiología médica. Mc Graw –Hill Interamericana, 2004

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Microbiología médica, José Ángel García-Rodríguez y Juan J. Picasso.

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3. Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas

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4. Wentworth BB, Baselkivs, Doern GV et al.

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