Técnicas de separación

[pic 1]Tema 5:

Técnicas de  

separación

Las técnicas instrumentales de separación son la cromatografía y la electroforesis. [pic 2]INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es una técnica analítica que permite separar, identificar y cuantificar los componentes  de mezclas complejas, que de otro modo no podrían ser resueltas.  

Todos los sistemas cromatográficos constan fundamentalmente de dos fases. La fase fija o estacionaria  inmovilizada sobre un soporte, y la fase móvil discurre por o a través de la fase estacionaria.  

La separación de los componentes de la mezcla se basa en la distinta velocidad a la que esos  componentes se mueven por la fase estacionaria arrastrados por la fase móvil. Esa velocidad depende  de la afinidad relativa de cada componente por cada fase.

La distribución de los componentes de la muestra entre las dos fases viene dada por el coeficiente de  distribución, de partición o de reparto, el cual expresa la cantidad de sustancia presente en una fase  estacionaria entre la cantidad de sustancia en la fase móvil.

Si los valores de K son demasiado pequeños, los solutos atraviesan la columna tan rápidamente que no  se produce separación importante. Si el coeficiente de partición es grande, los solutos quedan muy  retenidos y los tiempos necesarios para eliminar los solutos de las columnas son muy grandes.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA 

Los diferentes tipos de cromatografía dependen del criterio seguido para su clasificación. Se pueden  clasificar: según la disposición de la fase estacionaria, según el estado físico de la fase móvil y según el  proceso físico o químico por el que se produce la separación.

∙ Según la disposición de la fase estacionaria

La cromatografía puede ser plana o en columna

▪ Cromatografía plana. La fase estacionaria se coloca en un soporte plano, es la cromatografía en  capa fina (ccf) o bien es un papel, cromatografía en papel. La fase móvil se desplaza por la fase  estacionaria capilaridad o por la influencia de la gravedad.

▪ Cromatografía en columna. la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo estrecho y la  fase móvil se hace pasar por el tubo desplazándose por capilaridad, gravedad o presión.  

∙ Según el proceso físico-químico que tiene lugar

Se distinguen los siguientes tipos de cromatografías: de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, de  afinidad y de exclusión molecular (o filtración en gel), que se detallarán más adelante.

∙ Según el estado físico de la fase móvil

Puede ser cromatografía líquida y cromatografía gaseosa.  

En la tabla mostrada debajo se recogen las relaciones entre todos los criterios de clasificación. 

[pic 3]CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN  

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC o CLAR) emplea una fase móvil líquida y una  fase estacionaria embutidas en una columna. Para que la fase móvil se desplace entre esas  partículas a velocidad de flujo razonable es necesario aplicar presiones de varios cientos de  atmósferas, con ello se aumenta la resolución o capacidad de separación de los componentes  de la muestra. Es la técnica preferente para la separación de compuestos no volátiles y  térmicamente inestables.  

INSTRUMENTOS PARA HPLC 

Los componentes básicos de un cromatógrafo líquido de alta resolución son:  ∙ un reservorio de vidrio o acero para contener la fase móvil, que ha de estar previamente  filtrada y desgasificada

∙ un inyector para introducirla  [pic 4]

muestra en la columna

∙ una bomba que impulsa el paso de  

la muestra y la fase móvil a través  

de la columna.  

∙ una columna que es donde se  

produce la separación. Éstas  

suelen ser de acero con una  

longitud entre 10 y 30 cm y un  

diámetro interior entre 4 y 10 nm

∙ un detector que recoge las señales de los diferentes componentes al salir de la columna.  Pueden ser: generales - miden una propiedad física de la fase móvil (ejm: detector de  índice de refracción y el de conductividad); y selectivos – miden una propiedad del analito (ejm: el UV-visible, el de fluorescencia y el de electroquímico)

∙ un sistema de registro de la señal procedente del detector (ordenador, ...)

Inyectores 

Actualmente todos los inyectores utilizan bucles de muestreo (loops) con capacidad entre 5 y 500 μl  

Posición de carga: [pic 5]

la muestra se introduce  

mediante la jeringa en el  

bucle, mientras que el flujo  

de la bomba va hacia la  

columna sin pasar por el  

bucle.  

Posición de inyección:

el flujo se dirige hacia el  

bucle arrastrando la  

muestra a la columna.

TIPOS DE HPLC 

Surgen cinco tipos: adsorción, reparto, intercambio iónico, afinidad y exclusión dependiendo  del mecanismo de retención de los analitos en la fase estacionaria. De todos ellos nos  centraremos en:

1. De reparto o partición 

La fase estacionaria es un líquido inmovilizado sobre un sólido inerte e inmiscible con la fase  móvil. La separación tiene lugar por la diferencia de solubilidades de los componentes de la  mezcla en las dos fases.

Dependiendo de las polaridades de las fases móviles y estacionaria se distinguen dos tipos:  

∙ Cromatografía en fase normal. La fase estacionaria es polar (agua o trietilenglicol) y la fase  móvil presenta baja polaridad (éteres, cloroformo, cloruro de metileno, tetracloruro de  carbono, hidrocarburos alifáticos...). Así los compuestos menos polares eluyen primero por  ser más solubles en la fase móvil, quedando retenidos los compuestos polares. Para eluir  éstos hay que aumentar la polaridad de la fase móvil.  

∙ Cromatografía en fase reversa, la fase estacionaria es no polar (hidrocarburos) y la fase  móvil es relativamente polar, formada por disolventes como el agua, metanol o  acetonitrilo. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero y para eluir los  compuestos retenidos hay que disminuir la polaridad de los solventes utilizados.  

[pic 6]

La cromatografía de reparto en fase reversa es el tipo de cromatografía líquida más utilizado

2. De intercambio iónico 

Se basa en los equilibrios de atracción entre iones de signo contrario; por un lado, los de la  fase estacionaria y por otro, los de la fase móvil y el soluto.

La fase estacionaria es una  [pic 7]

resina, polímero de alto peso  

molecular, que contiene un  

gran número de grupos  

iónicos; es decir son  

polianiones o policationes  

insolubles.  

La fase móvil es una disolución  

acuosa que contiene grupos  

iónicos (contraiones) que  

compiten con los iones del  

analito (del mismo signo) por  

los grupos cargados (de signo  

contrario) sobre la superficie  

de la resina.  

Las resinas pueden ser: intercambiadoras de aniones (poseen grupos cargados positivamente y  atraen a las moléculas con carga negativa) e intercambiadoras de cationes (contienen grupos  cargados negativamente por lo que atraen a las moléculas con cargas positivas).  

La elución de la muestra se controla por pH, fuerza iónica, y polaridad de la fase móvil.

3. De tamizado 

La fase estacionaria son materiales poliméricos (geles) con una red uniforme de poros en los  que difunden las moléculas de la fase móvil y de la muestra. Como fase móvil se utilizan  disolventes adecuados para las moléculas que hay que separar, pero no constituyen un factor  determinante en la separación.

Los geles poseen enlaces entrecruzados. El grado de  [pic 8]

entrecruzamiento de los enlaces determina el tamaño de los  

poros o los huecos de los geles. A mayor entrecruzamiento  

menor tamaño de poro y por lo tanto, mayor dificultad en la  

penetración de las moléculas de los componentes de la  

muestra. Contrariamente, un bajo grado de entrecruzamiento  

origina tamaños de poro mayores y menos dificultad de  

penetración.  

La separación se basa en el tamaño y la forma de las moléculas  

de la muestra. Así, las moléculas de tamaño superior al del  

poro del empaquetamiento son excluidas y no experimentan  

retención, viajan por la columna a la velocidad de la fase móvil. Las moléculas de tamaño  menor al de los poros penetran en los poros y quedan atrapadas por más tiempo. En las  moléculas intermedias su poder de penetración depende del diámetro y de la forma.  

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