TIPOS Y FUNDAMENTOS DE PRUEBAS MOLECULARES
Enviado por Isaah_Ch • 13 de Febrero de 2019 • Documentos de Investigación • 746 Palabras (3 Páginas) • 251 Visitas
pacientes inmuno-suprimidos: personas con VIH, Diabetes o mujeres Embarazadas.
En bacterias los métodos convencionales son
- microbiológicas o bacteriología clínica que son cultivos y pruebas bioquímicas.
- serológicas que so EPEC o EHEC nos permiten detectar un antígeno o anticuerpo
- PCR
Para los virus:
- Cultivo. Es más caro y complicado porque se necesita la célula huésped para que el virus infecte.
- serología
- Molecular
Tipos de Métodos:
- Fenotípicos: todo lo que está sujeto a expresión
- Microbiología: pruebas bioquímicas (Gram +/-) y resistencia (expresión)
- Serología: detectando un antígeno o anticuerpo
en PCR se mide la secuencia, se busca reproducibilidad.
- Moleculares NO están sujetas a la expresión
La validez de un ensayo es
también se evalúa si es cuantitativo o cualitativo y la sensibilidad y especificidad de la prueba.
Etapas:
- Fin deseado:
- Detectar: Saber si es (+/-)
- Identificar: más específico, que microorganismo es.
- Screening: Voy a una población a aplicar métodos de diagnóstico aleatoriamente para saber positivos o negativos. Son con pruebas Serológicas. Más rápido y barato.
- Optimizar:
- Controles (+/-) y la muestra
- Normalización del ensayo: Yo lo aplico en el laboratorio
Con los Controles:
- Robustez: es la medida de la capacidad de la prueba de no resultar afectado por pequeñas variaciones. Mismos resultados sin importar el cambio de temperatura o cambio de laboratorios, equipos, reactivos o países.
- Repetitividad:
Lo primero que se debe detectar:
- Especificidad Analitica: que tan afín es. Capacidad del método de analizar entre el analito y otros componentes. Siempre solo debe detectar al analito. No es específica cuando no me detecta el microorganismo que yo quiero.
- Sensibilidad Analitica: Se hace con diluciones seriadas y solo con los controles.
Diluciones seriadas: tienes tubos con 9 microL por ejemplo y al primero le agregas 1 microL de ADN (1/10), mezclas y tomas de ese primer tubo otro microL y lo pasas al tubo 2 (1/100) lo mismo para el tubo 3 (1/1000) y así sucesivamente.
Gold standard/prueba de oro: La mejor prueba. Técnica estandarizada que siempre que hagas en ciertas condiciones te va a dar bien. La prueba más fácil de realizar.
Un método es óptimo si me da por encima del 90% en especificidad y sensibilidad.
La sensibilidad (Los positivos que le afecta los falsos negativos) y especificidad (los negativos que le afecta los falsos positivos) diagnóstica es para las muestras. Siempre lo que afecta es el denominador en la fórmula.
Controles | Optimal (+) | Optimal (-) |
positivo | VP | FN |
Negativo | FP | VN |
Tipos de PCR | Requisitos | Usos | Contaminación |
Multiplex | dNTPs, Buffer, Taq Polimerasa, aditivos, varios pares de primers | Amplifica varias secuencias en una sola corrida. Es una prueba con mucha sensibilidad. | No hay tanto riesgo |
Nested | dNTPs, Buffer, Taq Polimerasa, un primer, muestra de ADN | La amplificación se realiza en 2 rondas, puede ser prueba multiplex en la segunda ronda, ya que se pueden usar más de un par de primers. | Si hay riesgo por la sensibilidad de la prueba |
Reverse Transcriptase | dNTPs, Reverse Transcriptase, Tfl o Tth polimerasa (con reverse transcriptase activity), Mn2+, primers | Es usada para crear cDNA (ADN complementario) a partir de ARN para después amplificar la muestra de cDNA obtenido. | No hay tanto riesgo |
Random | dNTPs, Taq polimerasa, muchos primers, muchas muestras de ADN | Es una técnica usada para crear fingerprints y son usados varios primers con secuencias desconocidas | No hay tanto riesgo |
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