Tecnología De ADN Recombinante

La tecnología del ADN recombinante constituye una suma de técnicas siendo las más importantes:

- La rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales.

- La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica.

- La hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.

- La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas.

- La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos.

Vectores.

- Plásmidos. Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos.

El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción únicos.

- Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13.

Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede remplazarse por DNA exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo génico central.

Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una región central. Se aíslan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma enzima de restricción (en este ejemplo, con EcoRI).

Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas por transfección. Primero, se permeabilizan las células huésped mediante un tratamiento químico, y se mezclan con las moléculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran

en las células huésped, donde dirigen la síntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como alternativa, se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partículas fágicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.

- Los cósmidos y los vectores transbordadores

Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y

secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la

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