Tecnología del DNA Recombinante

TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

1. Elementos genéticos accesorios en bacterias

     La mayor parte del material genético en bacterias reside en su cromosoma. Que consiste en una molécula de DNA circular de unos 3º4 millones de pb (3.000-4.000kb). Además, muchas bacterias contienen elementos genéticos accesorios que son moléculas de DNA o RNA que se mantienen de forma autónoma respecto del cromosoma bacteriano. Su tamaño oscila entre 1 y unos cientos de kb y habitualmente no son necesarios para el crecimiento de la bacteria.

     Los elementos genéticos accesorios de bacterias tienen gran interés en biología molecular y son tratados en este libro por su importancia en el desarrollo de la tecnología del DNA recombinarte especialmente por haber servido como base para el desarrollo de los vectores de clonado molecular. Además, al ser versiones miniaturizadas del cromosoma bacteriano constituyen modelos en los que han sido estudiados mucho de los procesos básicos de la biología molecular.

     Aunque son numerosos los sistemas genéticos bacterianos que se conocen con cierto detalle, sin duda es Escherichia coli la bacteria a la que se ha dedicado una mayor atención y consecuentemente a ella se referirá la mayor parte de la materia presentada en los capítulos de biología molecular de procariotas. Por otra parte, toda la tecnología DNA recombinante cuyo fundamento descubriremos en este capítulo, utiliza E. coli como bacteria huésped de vectores y genes clonados.

1.   Plásmidos

     Un plásmido es una molécula de DNA que puede ser mencionada de forma estable e independiente del cromosoma. En bacterias la mayoría de los plásmidos son moléculas circulares covalentemente cerradas (CCC) y presentan superenrollamiento negativo. Los plásmidos se popularizaron por las propiedades fenotípicas que confieren a sus huéspedes. Resistencia a antibióticos patogenicidad, producción de antibióticos fijación de nitrógeno y diversas capacidades catabólicas son rasgos fenotipitos habitualmente asociados a plásmidos bacterianos. Nos referimos a tres propiedades básicas de lo plásmidos: el control de su replicación, la transmisibilidad y la incompatibilidad.

1. Control de la replicación

     La replicación es esencial para el mantenimiento establece de un plásmido en una población bacteriana. Dependiendo de la manera en la que los plásmidos controlan su replicación nos podemos encontrar con dos grandes grupos:

1. Plásmidos de control estricto. En los que la replicación del plásmido se sincroniza con la del cromosoma. El resultado es que el número de copias se mantiene bajo, en una o unas pocas copias por bacteria. Se necesita un preciso sistema de partición de forma que cada bacteria en la descendencia asegura la recepción de una copia de plásmido. Este tipo de plásmidos son habitualmente de tamaño “grande” (más de 30 kb.)

1. Plásmidos de control relajado. La replicación del plásmido se controla de forma independiente dando lugar a la existencia de un alto número de copias (por encima de 10 hasta varios cientos). Generalmente son plásmidos de pequeño tamaño (p. ej. ColE1). La replicación de los plásmidos de control relajado puede continuar en ausencia de síntesis proteica, como consecuencia de la vida media de las polimerasas y de que las proteínas de control de la replicación de la bacteria no son necesarias para la multiplicación del plásmido. Por esta razón, en presencia de un inhibidor de síntesis proteica por ejemplo el cloranfenicol, la replicación de estos plásmidos continúa durante horas, y su número de copias por bacteria puede llegar hasta varios miles.

b) Transmisibilidad: conjugación

     El primer plásmido al que se prestó atención fue el factor F, que se caracterizaba por la capacidad que confería a su hospedador de actuar como donador en cruces genéticos. El mecanismo de trasmisión genética que F codifica fue definido como conjugación. Muchos plásmidos comparten con F la propiedad de ser trasmisibles por conjugación. Todos ellos se denominan plásmidos conjugativos.

     Los genes de F que codifican la capacidad de ser conjugativo se encuentran organizados en un operón denominado traF que ocupa unas 30 kb. Un tercio del tamaño de F (95 kb). El operón traF contiene más de veinte genes. Y además de ellos, F necesita para la conjugación una secuencia llamada ori-T sobre el que actúan algunos productos de gene traF y que es el origen de transferencia. La conjugación es un proceso replicativo. El plásmido replica a partir de ori-T de una manera particular, que se conoce como el modelo del círculo rodante. De este modo se trasmite al recipiente una copia del plásmido mientras que otra permanece en el (Fig. 1.1). Otro componente de la maquinaria de conjugación es el pilus o pelo sexual. Es un filamento proteico formado casi exclusivamente por el producto de gen traA. Cuando entran en contacto células donadoras portadoras de un plásmido conjugativo y células recipientes en las condiciones adecuadas puede ocurrir la conjugación. Por mediación del pilus se establecen los contactos entre células. Normalmente se forman agregados de unas decenas de células en las que la proporción donador recipiente suele ser 1/10. Una vez que el contacto es efectivo. Posiblemente por fusión local de las membranas, se prepara el plásmido para la trasmisión por producción de una mella en ori-T. replicación y transferencia al recipiente. El recipiente recibe una copia de cadena sencilla, que debe de ser inmediatamente convertida en cadena doble para asegurar su estabilidad (Fig. 1.1).

      El operón tra de F suele estar reprimido por lo que su frecuencia de conjugación es moderada (solo uno de cada 1000 donadores conjuga). Cuando traF deja de estar reprimido, la frecuencia de conjugación puede alcanzar el 100%. Diferentes plásmidos poseen diferentes sistemas de conjugación con distinta organización genética (trsF, traP, traW, ETC). No obstante, lo descrito para F puede considerarse válido con carácter general. Un plásmido defectivo en alguno de los genes tra esenciales será no conjugativo. Sin embargo, si el plásmido posee el sitio ori-T, todavía podrá ser transferido en presencia de un plásmido conjugativo que le complemente. Esta clase de plásmidos no conjugativos se denominan plásmidos movilizables. Los plásmidos que no poseen secuencias similares a ori-T ni un operón tra no son ni conjugativos ni movilizables. Su única posibilidad de trasmisión es por fusión con otro plásmido conjugativo a través de un proceso recombinativo. A este modo de transferencia se le denomina conducción. Este tipo de plásmidos son los adecuados para experimentos de ingeniería genética en los que es deseable un alto grado de contención biológica.

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