Enzimas en la tecnologia del DNA recombinante

Tema 2: Enzimas en la tecnología del DNA recombinante

Herramientas esenciales para la ingeniería genética

• Han permitido el trabajo in vitro con ácidos nucleicos

• Gran eficiencia catalítica

• Gran especificidad

• Fuentes naturales: virus, bacterias, levaduras, hongos plantas y animales

• Purificadas: fácil accesibilidad y gran pureza

• Recombinantes: alto rendimiento, bajo coste, modificables

Principales enzimas modificadoras de los ácidos nucleico empleadas en la tecnología DNA recombinante

• Nuclear que digiere la molécula de DNA por el enlace fosfodiéster

1. Endonucleases de restitución las verdaderas enzimas que cortan el DNA

2. Otras nucleasas para ciertas aplicaciones

• Ligasas, fosfatasas y polinucleótidos quinas

• Polimerasa

1. DNA polimerasas dependientes de DNA: Utilizan otra molécula de DNA como template.

2. DNA polimerasas dependiente de RNA: Utiliza como template a una molécula de RNA. Es un buen ejemplo de retrovirus. También esta la telomerasa que alarga los cromosomas con un molde de DNA.

3. RNA polimerasas. Se usan las cadenas de RNA. Necesitan un molde. Están en la transcripción.

Nucleasas:

1. Sustrato:

a. DNasas

b. RNasas

c. DOble especificidad

2. Cadena

a. Sencilla

b. DOble

c. Doble especificidad

3. Lugar de Ataque:

a. Exonucleasas (extremos): corta por los extremos

• Unidireccional

• Bidireccionales

b. Endonucleasas (interior): rompen moléculas circulares de DNA)

4. Forma de Ruptura:

a. Tipo a: entre 3 OH y P: extremos 5-P

b. Tipo p: entre P y 5 OH: extremos 3-P

Las endonucleasa siempre se cortan como tipo a.

Endonucleasa de restrición: funciona como dímeros

• Reconocen secuencias cortas de DNA: diana (4,5,6,8 nucléotidos): Tres tipos: solo las de tipo II útiles en laboratorio

• Específicas: sólo cortan cuando aparece la diana

1. Dentro de la diana o au na distancia fija de ella

2. Siempre cortan igual, en los mismos puntos

• Enorme variedad: dianas diferentes

Si es de 4 cortan antes de 4 y siempre corta igual y por dentro.

• Simeterí palindrómica: abajomemojaba, radar

• Corte tipo a: extremos 5-P y 3-OH

• Metilasas asociadas: metilan una posición en la misma diana

El descubrimiento de estas enzimas es como un sistema de defensa de DNA extraño. Cada bacteria tiene su propias enzimas metilasas. Las metilasas reconocen la misma secuencia de su pareja de la enzima de restricción.

Si aparece un DNA exógeno puede tener un patrón de metilación del DNA, pero es otra secuencia. Cuando entra a la bacteria la enzima de restricción no lo va a reconocer y por ende, lo va a digerir. Por eso es un sistema de defensa.

Tipos de endonucleasas de restricción: Imp. la de tipo II. PPT.

Endonucleasas de restricción: simetrís de corte.

Ej. 5’- GTTAAC-

-CAATTG-5’

1. Extremos romos es que corta en el eje simetría.

2. Corta en diferente lugar, pero por su complementaria. Se llama extremos cohesivos con saliente en 5 prima o protuberantes. Genera esto siempre leyendo que la enzima corte antes del ejer simetría.

3. El punto de corte se produce después del punto de simetría. Se llama extremos cohesivos con saliente 3 prima.

• Moléculas con extremos cohesivos compatibles emparejan: no romos con cohesivo 5 prima.

• Pueden provenir

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