Tratamiento con DNasa

Tratamiento con DNasa.

1. A partir de las muestras obtenidas en la extracción de TRIZOL, se realiza el tratamiento de DNasa con RQ1 de PROMEGA.

2. Dependiendo del número de muestras se debe realizar el siguiente mix. (tabla 1)

N° Rxs. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Buffer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

DNasa 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Vol. final 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

3. Del mix resultante se deben repartir 4 ul en tubos de 0,2 ul.

4. Agregar a cada tubo 6 ul de RNA (muestras ya tratadas de TRIZOL).

5. Incubar por 30 min a 37° C.

6. Luego agregar 1.0 ul de STOP Solution.

7. Incubar a 65°C por 10min.

Extracción de RNA usando TRIZOL.

1. Homogenizar el tejido en 200 ul de TRIZOL.

2. Incubar las muestras homogenizadas por 5 min. a T° ambiente.

3. Adicionar 40 ul de Cloroformo por cada ml de TRIZOL, utilizando para homogenizar las muestras y agitar manualmente con fuerza por 15 seg.

4. Incubar 2 – 3 min. a T° ambiente y luego centrifugar a 12000 xg por 15 min.

5. Recuperar fase acuosa (SUPERIOR) hacia un tubo limpio, con mucho cuidado, sin arrastrar suciedad de la fase inferior.

6. Adicionar 100 ul Isopropanol e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.

7. Centrifugar a 12000 xg por 10 min. y descartar sobrenadante cuidadosamente.

8. Adicionar 200 ul de etanol al 75 % y mezclar usando vortex.

9. Centrifugar a 7500 xg por 5 min. y retirar sobrenadante. Dejar secar 5 a 10 min. a temperatura ambiente, sin dejar secar por completo.

10. Resuspender pellet en 30 ul de agua grado PCR (ROCHE).

11. Realizar tratamiento con DNasa I previo RT.

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