TÉCNICAS MOLECULARES PARA EVALUAR LA ESTRUCTURA MICROBIANA COMUNIDAD, FUNCIÓN Y DINÁMICA EN EL MEDIO AMBIENTE

Hay métodos importantes en la investigación de la ecología microbiana de ambientes naturales y antropogénicos. Con los recientes avances en genómica y tecnologías de secuenciación, análisis de la comunidad microbiana utilizando técnicas moleculares ha iniciado una nueva era de la ecología microbiana. Los análisis moleculares de las comunidades ambientales han revelado que la fracción cultivable representa <1% del número total de especies procariotas presentes en cualquier muestra dada. Enfoques moleculares, tales como la huella genética, la metagenómica, etaproteomica, metatranscriptomica y proteogenómica son vitales para el descubrimiento y la caracterización de la gran diversidad microbiana y la comprensión de sus interacciones con factores ambientales bióticos y abióticos.

La biosfera está dominada por microorganismos y contiene alrededor de 4.6 × 1030 células procariotas (Whitman et al., 1998). Este número representa al menos dos o tres órdenes de magnitud más que todas las células animales y vegetales combinados. La comprensión de esta diversidad genética inexplorado es un tema de alta prioridad en la ecología microbiana de perspectivas, como el cambio climático global y el efecto invernadero.

Los microbios desempeñan un papel fundamental en la modulación de los ciclos biogeoquímicos globales e influir en todas las vidas en la Tierra (Garbeva et al. 2004). La comprensión de la dinámica microbiana y sus interacciones con factores bióticos y abióticos es indispensable en las técnicas de biorremediación, los procesos de generación de energía, y en las industrias biotecnológicas tales como productos farmacéuticos, alimentos, química, y la minería.

Métodos de cultivo en Ecología Microbiana: Aplicaciones y Limitaciones

Las técnicas de cultivo estándar para caracterizar la ecología microbiana implican aislamiento y caracterización de microorganismos utilizando medios de cultivo comerciales como medio Luria-Bertani, agar nutriente y agar de soja tríptica (Kirk et al. 2004).

La principal limitación de las técnicas basadas en el cultivo es que> 99% de los microorganismos presentes en cualquier entorno observadas a través del microscopio no son cultivables por técnicas de cultivo estándar (Hugenholtz 2002). Varios procedimientos de cultivo mejoradas y medios de cultivo se han ideado que imitan los entornos naturales en términos de nutrientes (composición y concentración), gradiente de oxígeno, pH, etc., para maximizar la fracción cultivable de las comunidades microbianas. Estos organismos, aunque viable en sus entornos naturales, no crecen en condiciones de laboratorio y se mantienen en una etapa (VBNC) "viable pero no cultivable" (Oliver 2005). Estos organismos podrían VBNC representan grupos completamente nuevos y pueden ser abundantes o muy activos, pero permanecen sin explotar por métodos de cultivo convencionales.

Encuestas microbianas moleculares basados en los genes 16S rRNA revelar que el candidato divisiones bacterianas como BRC1, OP10, OP11, SC3, TM7, WS2 y WS3 no tienen representantes en cultivo y son conocidos sólo por sus secuencias moleculares (Schloss y Handelsman 2004). Estos subtipos de nivel división, como OP11, son muy diversos y ampliamente distribuido en diferentes ambientes y son considerados como "divisiones candidatos" para reflejar nuestro conocimiento limitado debido a la falta de cualquier representante culta. Los estudios sugieren la existencia de al menos 50 phyla bacteriana con medio representado en su totalidad por secuencias moleculares (Schloss y Handelsman 2004). Además, los microorganismos recuperados utilizando métodos de cultivo comunes rara vez son numéricamente abundante o funcionalmente significativo en el medio ambiente de los que se cultivaron.

Estos microorganismos cultivados se consideran como las "malas hierbas" del mundo microbiano y constituyen <1% de todas las especies microbianas (Hugenholtz 2002). Aunque Acidobacteria constituye en promedio el 20% de las comunidades de bacterias del suelo, estos organismos son difíciles de cultivar y están representados por unos pocos géneros (Schloss y Handelsman 2004). Estos hallazgos sugieren que las técnicas moleculares que eluden la necesidad de aislamiento y cultivo son altamente deseables para la caracterización en profundidad de las comunidades microbianas del medio ambiente.

Métodos moleculares de análisis microbiano de la Comunidad

La gran mayoría de las comunidades microbianas en la naturaleza no se han cultivado en el laboratorio. Por lo tanto, la fuente primaria de información para estos organismos no cultivados pero viables son sus biomoléculas tales como ácidos nucleicos, lípidos, y proteínas, estos incluyen análisis de genomas enteros o genes seleccionados como 16S y 18S ARNr (ARN ribosomal) para procariotas y eucariotas, respectivamente. Con base en los análisis comparativos de estas firmas rRNA, la vida celular se ha clasificado en tres dominios principales: un eucariota (Eukarya) y dos procariotas (bacterias y arqueas) (Hugenholtz 2002). Las técnicas se han clasificado en dos grandes categorías en función de su capacidad de revelar la estructura de la diversidad microbiana y la función: los enfoques de análisis parcial de la comunidad y los enfoques de análisis de la comunidad entera.

Análisis de Enfoques parciales de la Comunidad

Estas estrategias incluyen generalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) métodos basados en donde se utiliza ADN / ARN total extraído de una muestra ambiental como una plantilla para la caracterización de los microorganismos. En principio, el producto de PCR generado de esta manera refleja una mezcla de firmas de genes microbianos a partir de todos los organismos presentes en una muestra, incluyendo la fracción VBNC. Amplificación por PCR de genes conservados, tales como 16S rRNA de una muestra ambiental se ha utilizado ampliamente en ecología microbiana principalmente debido a que estos genes (1) son ubicuos, es decir, presente en todos los procariotas, (2) están estructural y funcionalmente conservados, y (3) contener regiones variables y altamente conservadas (Hugenholtz 2002). Otros genes conservados, tales como la ARN polimerasa de subunidad beta (rpoB), beta-girasa subunidad (gyrB), recombinasa A (recA), y la proteína de choque de calor (hsp60) también se han utilizado en las investigaciones microbianas y para diferenciar algunas especies bacterianas (Ghebremedhin et al . 2008). Los productos de PCR amplificados a partir de ADN ambiental se analizan principalmente por (1) método de biblioteca de clones, (2) la huella genética, (3) microarrays de ADN, o mediante una combinación de estas técnicas.

Método para Clonar Biblioteca

El método más utilizado para analizar los productos de PCR amplificados a partir de una muestra ambiental es clonar y luego secuenciar los fragmentos de genes individuales (DeSantis et al., 2007). Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias conocidas en una base de datos como GenBank, Ribosomal Database Project (RDP), y Greengenes, se asignan a filo, clase, orden, familia, subfamilia, o especies en la similitud de secuencia valores puntuales corte de 80, 85, 90, 92, 94, o 97%, respectivamente (DeSantis et al. 2007). Mientras bibliotecas de clones de genes 16S rRNA permiten un estudio inicial de la diversidad y la identificación de nuevos taxones, los estudios han demostrado que las muestras ambientales como el suelo pueden requerir más de 40.000 clones para documentar el 50% de la riqueza (Dunbar et al., 2002). Sin embargo, bibliotecas de clones típicos de genes 16S rRNA contienen menos de 1.000 secuencias y por lo tanto revelan sólo una pequeña parte de la diversidad microbiana presente en una muestra.

Técnicas de huellas genéticas

La huella genética genera un perfil de las comunidades microbianas basadas en el análisis directo de los productos de PCR amplificados a partir de ADN del medio ambiente (Muyzer 1999). Estas técnicas incluyen DGGE / TTGE, SSCP, RAPD, ARDRA, T-RFLP, LH-PCR, RISA, y RAPD y producen una huella digital comunitaria basada en el polimorfismo de secuencia o polimorfismo de longitud. Denaturing- o Temperatura-Gradient Gel

Electroforesis

En la electroforesis en gel desnaturalizante de gradiente (DGGE), los productos de PCR se obtienen a partir de ADN ambiental utilizando cebadores para un marcador molecular específico (por ejemplo, 16S rRNA gene) y electroforesis en un gel de poliacrilamida que contiene un gradiente lineal de desnaturalizante del ADN, tales como una mezcla de urea y formamida (Muyzer et. al 1993). Electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TTGE) se basa en el mismo principio de DGGE excepto que se aplica un gradiente de temperatura en lugar de desnaturalizante químico.

Polimorfismo de conformación de cadena sencilla

Los productos de PCR se desnaturalizan ambientales seguido de la separación electroforética de fragmentos de ADN de cadena sencilla en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante (Schwieger y Tebbe 1998).

La separación se basa en las diferencias sutiles en las secuencias (a menudo un solo par de bases), lo que resulta en una estructura secundaria plegada diferentes que conducen a una diferencia mensurable en la movilidad en el gel. A diferencia de DGGE, la tecnología de SSCP no requiere ningún GC cebadores sujetos al suelo geles de gradiente, o aparato electroforético especializada; por lo tanto, es una técnica más simple y directo de DGGE. Similar a DGGE, las bandas de ADN se puede escindir a partir del gel, volvió a amplificar, y se secuenciaron. Sin embargo, SSCP es muy adecuado sólo para pequeños fragmentos (entre 150 y 400 pb) (Muyzer

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