Técnicas Moleculares

Resumen

La regulación genética mediante el control de la transcripción se ha analizado con gran detalle tanto en procariotas como en eucariotas. La frecuencia de la transcripción puede disminuirse mediante represores o aumentarse mediante activadores. Un represor puede funcionar disminuyendo la concentración de ARN polimerasa en un promotor capaz de formar un complejo abierto. Un activador puede funcionar aumentando la concentración de ARN polimerasa en un promotor capaz de formar un complejo abierto. Para este propósito, una estrategia se usa una y otra vez. Se llama aumento en la concentración local. La forma en que Escherichia coli usa esta estrategia de manera eficiente se discute.

Introducción INHIBIDOR ES REPRESOR LAC.

Escherichia coli tiene 4288 marcos de lectura abiertos (Blattner et al., 1997). Por lo tanto, aproximadamente 4000 proteínas están presentes en una célula de E. coli bajo diversas condiciones en diversas concentraciones. El volumen de una célula de E. coli es de aproximadamente 2  10¹12 cm3, por lo que la concentración de una molécula por célula de E. coli en diversas condiciones es de aproximadamente 10¹9 M. Cuanto mayor es la concentración de una proteína, mayor es la probabilidad de que pueda interactuar con sus moléculas diana. La concentración de una proteína puede aumentar localmente mediante la unión específica a moléculas que forman andamios que se encuentran solo en áreas particulares de la célula. El ADN es un andamio. Una proteína debe tener dos sitios distintos para poder aumentar su concentración local: un sitio para reconocer sitio (s) en el andamio específicamente, y otro sitio para interactuar con su objetivo principal (Oehler et al., 1990, 1994).

INTERACCIÓN ENTRE DOS PARTES LEJANAS DEL  ADN

En 1977, Kania y Muler-Hill propusieron que el represor Lac tetramérico se uniera con sus dos dímeros a dos operadores diferentes y así formar bucles de ADN. El hecho de que el bucle de ADN realmente ocurre y juega un papel funcional fue demostrado por primera vez en el sistema de arabinosa por Dunn et al. en 1984. Mossing y Record demostraron en 1986 que los operadores ascendentes aumentan la represión del promotor lac. Al mismo tiempo, se dilucidó el mecanismo por el cual los activadores que se unen en los sitios de los promotores activan sus promotores. ¿Lo hacen distorsionando el ADN o incrementando la concentración local del activador para la ARN polimerasa unida al promotor? Se demostró que los sitios potenciadores también son activos cuando están colocados en un ADN no unido de un catenano: no tienen que estar posicionados en la misma molécula de ADN que el promotor para ser activo (Dunaway y Droge, 1989; Wedel et al., 1990). Esto implica que el PLEGAMIENTO de ADN ocurre a través de un aumento en la concentración local.

El bucle de ADN se ha discutido extensamente, pero citaré simplemente la revisión de Matthews (1992). Curiosamente, las consecuencias mecanicistas del aumento de la concentración local para el bucle y, por tanto, para la represión o la activación no siempre se han visto claramente. Me gustaría discutir estos asuntos aquí. Me concentraré primero en los sistemas lac y gal.

Gal dimérico versus el represor tetracémico de Lac

Los represores diméricos se pueden unir específicamente a sitios palindromáticos discretos de ADN que están cerca unos de otros y cerca de un promotor. Aumentan su concentración local alrededor del promotor solo marginalmente, posiblemente deslizándose, si hay un sitio adicional que usan para unirse al ADN. Por lo tanto, la concentración local efectiva del represor Gal dímero solo aumenta marginalmente para los promotores gal cuando dos dímeros se unen 114 bp a dos operadores aguas arriba y aguas abajo de los dos promotores gal (la distancia siempre se cuenta desde el centro de simetría al centro de simetría) . Entonces, ¿por qué hay dos operadores gal? Dos represores Gal vinculados a ellos promueven la unión de una proteína represora adicional, HU (Aki y Adhya, 1996).

La situación es fundamentalmente diferente con el represor Lac. El represor Lac es una proteína tetramérica que está presente en aproximadamente 10 copias por célula (Gilbert y Muöller Hill, 1966). Se une específicamente con dos subunidades (Kania y Brown, 1976) al operador lac O1, que está situado 10 pb aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción del promotor lac (Maizels, 1973). El represor Lac por lo tanto dificulta la unión de ARN polimerasa al promotor lac uniéndose a O1 (Maizels, 1973; Schlax et al., 1995). La represión es alrededor de 1000 veces en el tipo salvaje. La represión puede reducirse 30 veces mediante sustituciones individuales en O1. Está completamente abolido cuando O1 es destruido por varias sustituciones (Oehler et al., 1990).

Pseudo o operadores auxiliares?

Cuando se secuenció la región promotora lac, se descubrieron dos secuencias de ADN que se asemejan a O1 (Reznikoff et al., 1974; Gilbert et al., 1975). Se llamaron O2 y O3. O2 se encontró 401 pb aguas abajo de O1, y O3 se encontró 92 pb aguas arriba de O1. No se encontraron mutaciones constitutivas en O2 u O3. Parecían no tener ninguna función y, por lo tanto, se pensaba que eran restos no funcionales de la evolución. En ese momento parecía apropiado llamarlos pseudooperadores.

Mossing y Record, 1986, mostraron por primera vez que algo estaba mal con esta interpretación. Demostraron que los operadores colocados aguas arriba del promotor lac aumentan su represión. Luego, un análisis más detallado indicó que la destrucción de O2 u O3 disminuye la represión de lac de dos a tres veces, pero la destrucción de O2 y O3 disminuye la represión de lac 70 veces (Oehler et al., 1990). Por lo tanto, O2 y O3 se denominaron operadores auxiliares en lugar de pseudooperadores (Oehler et al., 1990). ¿Cómo funcionan los operadores auxiliares como O2 y O3? Propusimos la formación de bucles por el represor Lac tetramérico, ya sea entre O1 y O3 o entre O1 y O2 (Oehler et al., 1990; 1994; Muérler et al., 1996). ¿Por qué tal bucle aumentaría la represión? Invocamos el aumento de la concentración local de dímeros represores de Lac libres con respecto a O1 cuando el represor de Lac tetramérico se une a O2 u O3 (Oehler et al., 1994; Oehler y Muéller Hill, 1995; Müller y col. , 1996). Por lo tanto, más represor Lac estaría ligado a O1. La concentración de O1 libre disminuye y la represión aumenta de manera correspondiente (Schlax et al., 1995).

Consecuencias del concepto de concentración local

Las estimaciones de este cálculo son crudas, especialmente cuando se trata de volumen y concentración. Además, el ADN y las proteínas no son libremente flexibles. Sin embargo, el concepto de cambios cuantitativos en la concentración local parece intuitivamente correcto. Hace predicciones que pueden ser probadas:

1 Si colocamos un operador auxiliar perfecto a más de 1000 bp aguas abajo o aguas arriba de O1, no debería tener ningún efecto. A esta distancia, no hay un aumento significativo en la concentración local (Fig. 1).

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