Veterinaria

INTRODUCCIÓN

Los agentes antimicrobianos en medicina veterinaria son la principal herramienta terapéutica en el control y tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas en animales de producción; sin embargo, la presencia de residuos de estos quimioterápicos en la leche se ha convertido en un tema de interés en los consumidores (Jones y Seymour, 1987; Hutchinson y Sears, 1994).

Diversos estudios han puesto de manifiesto que entre los principales problemas en salud pública que generan los residuos de antimicrobianos en productos de origen animal figuran las reacciones anafilácticas (Van Arsdel, 1983), alteraciones de la flora intestinal humana (Gorbach, 1993) y alteraciones tóxicas específicas como es el caso de cloranfenicol (Kucers, 1980).

Las quinolonas, en particular, poseen efectos adversos específicos a nivel de cartílago de crecimiento en diversos animales jóvenes de laboratorio, comprobándose también este efecto en niños (Stahlman y Lode, 1989). En humanos, su uso se ha restringido fuertemente, contraindicándose en el caso de niños, adolescentes, mujeres en estado de gestación y lactancia. La artropatía en las especies juveniles se ha observado con todas las quinolonas, sin embargo el mecanismo por el cual se produce este efecto aún permanece sin aclarar. Los hallazgos patológicos, macroscópicos y microscópicos, en perros y ratas de laboratorio enfrentados a quinolonas, son de agrupación de condrocitos y erosiones en el cartílago de crecimiento de las articulaciones que soportan el mayor peso del animal (World Health Organization, 1995; Center for Veterinary Medicinal Products, 1998).

Las quino lonas pueden además afectar en forma inespecífica diversos sistemas, provocando alteraciones a nivel gastrointestinal, renal, cardiovascular, sistema nervioso central, ocular, como también alteraciones en la espermatogénesis, mutagenicidad y fotosensibilidad (Stahlmann y Lode, 1989).

La enrofloxacina es una fluoroquinolona que actúa sobre algunas bacterias gramnegativas y grampositivas; es recomendada para el tratamiento de enfermedades respiratorias, gastrointestinales y urinarias de bovinos, cerdos y aves en la Unión Europea (Center for Veterinary Medicinal Products, 1998).

En la reunión número 43 del Comité de Expertos de la OMS (World Health Organi-zation,1995), celebrada en Ginebra, se dio un MRL de 10 ng/ml hipotético para enrofloxacina en leche bovina, basándose en métodos analíticos con límites de cuantificación de 5 ng/ml para esta droga en leche.

Por otro lado, la Agencia Europea de Evaluación de productos Medicinales (Center for Veterinary Medicinal Products,1998), recomendó la inclusión de enrofloxacina en vacas lactantes con un MRL de 100 ng/ml en leche bovina, considerando la suma de residuos de enroflo-xacina y ciprofloxacina.

Existen diversos métodos basados en la Cromatografía Líquida de Alta Precisión, para la determinación de enrofloxacina y su metabolito ciprofloxacina en diferentes tejidos (Hormazabal y col., 1991; Martínez y col., 1997); sin embargo, existen escasas publicaciones para la determinación de éstos en leche (Roybal y col., 1997).

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método por Cromatografía Liquida de Alta Precisión rápido, simple y con buena sensibilidad para ladeterminación simultánea de residuos de enrofloxacina y ciprofloxacina en leche bovina.

MATERIAL Y MÉTODOS

Reactivos: Enrofloxacina (100% pureza) se obtuvo de Bayer Chile, mientras que ciprofloxacina (98.3% pureza) fue obtenido del Instituto de Investigaciones y Ensayos Farmacológicos de la Universidad de Chile (IDIEF, Universidad de Chile). Todos los reactivos químicos fueron grado analítico. Estos fueron:

- Acetonitrilo grado HPLC (J.T. Baker).

- Agua grado HPLC (Millipore).

- Acido acético grado ACS, glacial, libre de aldehido (Riedel de Haën), para preparar soluciones acuosas al 1 y 2%.

- Sulfato de sodio grado ACS, anhidro (Riedel de Haen).

- Etanol absoluto: alcohol etílico deshidratado(Riedel de Haën).

- Fase móvil: acetonitrilo-ácido acético al 2% (15:85).

- Solución de extracción: ácido acético al 1%- etanol absoluto (1:99).

- Filtros: 13 mm x 0,45 mm nylon (Gelman Science)

SOLUCIONES STOCK Y CONCENTRACIONES DE TRABAJO PARA CADA ANALITO:

a. Soluciones stock (1000 mg/ml): Se pesaron 25.0±0.5 mg (después de corregir según pureza) de enrofloxacina y ciprofloxacina. Cada una se diluyó en 25 ml de NaOH 0,03 M. Estas se almacenaron a 4°C protegidas de la luz, condiciones bajo las cuales son estables por 30 días.

b. Solución intermedia (1 ug/ml): 25 ml de la solución stock de enrofloxacina y ciprofloxacina se diluyeron en 25 ml de ácido acético al 1%, quedando una solución intermedia de 1.0 mg/ml (s.i.). Esta se preparó el día en que se analizaron.

c. Concentraciones de trabajo de los analitos puros : De la s.i. se utilizaron alicuotas de .5, 10, 20, 40, 80 y 100 ul y se enrasaron a 2 ml con ácido acético al 1%, quedando concentraciones de 2,5, 5, 10, 20, 40, 50 ng/ml respectivamente. Estas se prepararon el día en que se analizaron.

d. Concentraciones de trabajo de los analitos en las muestras fortificadas*: De la s.i. se utilizaron alicuotas de 25, 50, 100, 200 y 250 ml para agregar en 5 ml de leche control, obteniéndose niveles de fortificación de 5, 10, 20, 40, 50 ng/ml de leche, respectivamente. Estas se prepararon el día en que se analizaron las muestras.

Muestras: Se utilizaron tres tipos de leche: leche en polvo, leche pasteurizada y leche cruda libres de antibióticos; esta última fue mantenida a-25°C hasta su análisis.

La leche cruda se obtuvo de vacas en producción láctea, clínicamente sanas de la Estación Experimental "La Platina", INIA, Santiago, Chile. Los animales no recibieron tratamiento

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