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MICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

E.A.P. ENFERMERÍA

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UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

FACULTADDE MEDICINA HUMANA

E. A. P ENFERMERÍA

CURSO: MICROBIOLOGÍA

TEMA: PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA

DOCENTE: HUAYNA DUEÑAS LUS

CICLO: III

ALUMNO(A)S: CUEVA EUSEBIO PILAR

RUIZ SOLSOL CLAUDIA

SANDOVAÑ ZELADA MANUEL

TÁVARA DE LA GALA SYLVIA

TORRES CHUMBES MAYRA

HUACHO – PERU

2012

PRACTICA N° 10

PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA (MÉTODO DE DISCO DIFUSIÓN-KIRBY Y BAUER O ANTIBIOGRAMA)

1. OBJETIVOS

• Conocer en que se basa la elección de un antimicrobiano para el tratamiento de una infección y los motivos por los que se realizan las pruebas de sensibilidad y cuando está indicado hacerlas.

• Describir los procedimientos para la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana mediante el método de disco difusión (Kirby – Bauer) e interpretación de los resultados.

• Conocer los principales mecanismos por lo que las bacteria se hacen resistentes a la acción de un antimicrobiano.

2. FUNDAMENTOS

• La actividad antimicrobiana in-vitro determina: a) la potencia de un agente antimicrobiano en solución, b) su concentración en los líquidos en el cuerpo o en los tejidos, c) la sensibilidad de un microorganismo dado a concentraciones conocidas del medicamento (antimicrobiano).

• Es una prueba in-vitro que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el antibiótico más eficaz en el tratamiento de una infección determinada.

• Consiste en efectuar un cultivo del microorganismo en el medio más apropiado y después diseminarlo en la placa Petri con agar, al que se le colocan los discos de papel de filtro impregnados con solución de antibióticos (método de difusión).

Método de difusión:

 Se coloca un disco de papel filtro conteniendo cantidades conocidas del medicamento sobre un medio que ha sido sembrado en forma abundante con el microorganismo de prueba.

 Después de la incubación se mide el diámetro de la zona clara de inhibición que rodea el disco antibiótico.

 El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado a una concentración determinada, permite determinar diámetros críticos que delimitan las categorías sensible, intermedio y resistente (S.I.R), son el resultado de la integración de un conjunto de elementos: la distribución de la CIM (concentración inhibitoria mínima) para diversas poblaciones de cepas sensibles y resistentes, las concentraciones séricas y tisulares de los

antibióticos, la confrontación de los resultados in-vitro y de los resultados clínicos, asi como la variabilidad estadística de los métodos utilizados.

 Procedimiento de categorización:

Para los principales antibióticos, los valores críticos de las concentraciones bajas (c) y altas (C) y de sus diámetros correspondientes (d, D), permiten la categorización según los siguientes criterios (Tabla 1):

Tabla 1. Categorización

Categorías Concentración Inhibitoria Minima, CIM (mg/L) Diámetro de halo de inhibición, DHI (mm)

S CIM < c DHI > D

R CIM < C DHI < d

I C < CIM < C D < DHI < D

Por otra parte la lectura interpretativa del antibiograma, fundada en el conocimiento de los antibiofenotipos de sensibilidad y resistencia permite recategorizar un resultado inicialmente S en I o R debido al riesgo de fracaso terapéutico. Esta lectura interpretativa requiere la identificación correcta realización del antibiograma.

 Se ha señalado la existencia de factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in-vitro, entre ellos están:

 El pH del medio de cultivo, siendo que algunos antibióticos son mas activos a un pH acido (ej: nitrofurantoina) otros a pH alcalino (ej: aminoglucosidos, sulfonamidas).

 Los componentes del medio de cultivo, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas desde 40% para la meticilina y 98% para la dicloxacilina.

 Estabilidad de los medicamentos, asi a la temperatura de la incubación varios agentes antimicrobianos pierden su actividad.

 Cuanto mas grande sea el inoculo bacteriano, mas baja será la sensibilidad del microorganismo.

 Cuando mas tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad que tienen de presentarse las mutantes resistentes, igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son mas sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en la fase de reposo.

3. MATERIALES

• Refrigeradora.

• Autoclave.

• Incubadora microbiológica.

• Baño maría.

• Espectrofotómetro.

• Vortex(agitador para tubos de prueba).

• Regla milimétrica o vernier.

• Pinza punta plana, estéril.

• Hisopos de algodón, estériles.

• Pipetas milimétricas de 1ml, 5ml, estériles.

• Cloruro de bario (BaCl2).

• Acido sulfúrico (H2SO4).

• Suspensión de Sulfato de Bario (0.5 de la Escala de Mac Farland como estándar).

• Solución salina o caldo tripticasa soya, estéril.

• Placas Petri con Agar MuellerHinton, Agar MuellerHinton con 5% de sangre de carnero o Haemohhilus test médium (HTM), con 25 ml del medio de cultivo para las placas de 90 mm de diámetro.

• Discos de antibióticos, 6 mm de diámetro.

• Tubo de prueba con caldo tripticasa soya (TSC) sembrado con cepa bacteriana identificada.

4. PROCEDIMIENTO

1) Preparación del inoculo (Método de desarrollo previo):

a) Seleccionar 4 a 5 colonias bien aisladas, del mismo tipo morfológico, de un cultivo en placa.

b) Tocar la superficie de cada colonia con unasa de siembra y transferirlo a un tubo que contenga de 4 a 5 ml de caldo apropiado (Ej. Caldo tripticasa soya).

c) Incubar el caldo a una temperatura entre 35°C a 37°C, hasta que alcance o exceda la turbidez del estándar 0.5 de la escala de Mc Farland (por lo general de 2 a 6 horas).

d) Ajustar la turbidez del inoculo con solución salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escala de Mc Farland, por comparación visual con el estándar. Para realizar este paso correctamente, usar una luz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con líneas negras como contraste.

e) La suspensión preparada contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml de la cepa bacteriana.

2) Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inoculo, sumergir un hisopo estéril en la suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared del interior del tubo por encima del nivel del líquido para remover el exceso del inoculo.

3) Inocular la superficie seca de la placa de MuellerHinton, estriando con el hisopo en 3 direcciones para asegurar una distribución uniforme del inoculo. Antes de colocar los discos de antibióticos dejar secar la placa a temperatura de ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.

4) Colocar los discos de antibióticos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la superficie del agar.

5) Distribuir los discos uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 20 mm uno del otro. No deben colocarse más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni mas de 6 en una placa de 100 mm de diámetro interno, para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Un disco no debe ser removido una vez que tomo contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibióticos se difunden rápidamente.

6) Incubar las placas en posición invertida a 35°C por 24 horas según la bacteria investigada, dentro de los minutos posteriores a la aplicación de los discos.

7) Las placas de Haemophilusspp y streptococcusspp, deben ser incubadas en atmosfera de 5% de CO2.

8) Después del tiempo recomendado de incubación, examinar cada placa y medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.

5. RESULTADOS

LECTURA DE LA PLACAS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

1) Medir los diámetros de las zonas de inhibición completa (donde no crecen los microorganismos “halo vlaro”, incluyendo el diámetro del disco), usando una regla o calibrador. Se debe tener iluminada la parte posterior de la placa Petri con una luz reflejada localizada a unos cuantos centímetros sobre un fondo negro.

2) En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemolisis sino la de inhibición del crecimiento.

3) El

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