Determinación de proteínas usando el método Biuret

Introduccion

´Para dar inicio laboratorio primero que todo debemos saber que a través de la absorciometria podemos determinar la concentración de una sustancia con la condición de que absorba luz en el espectro visible

Como se aplica la ley de Lambert-beer -🡪 para determinar la concentración de un cromóforo puro necesitamos el coef de extinción molar ɛ del cromóforo y se debe medir la absorbancia de la muestra problema utilizando un espectrofotómetro al lamda máximo de absorción ƛ (540nm) y ese se lo utilizamos del valor teórico

A = ε ·c ·l Donde: • A = absorbancia • ε = Coeficiente de extinción molar. • l = longitud de la celda. • C = concentración

Curva de calibración🡪 es una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra problema.

En muchas determinaciones se cumple una relación directamente proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca.

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¿Para qué se realiza las determinaciones de proteínas en muestras clínicas?

SIGNIFICACION CLINICA La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc

Absorciometria: Técnica que permite calcular la cant de fotones que han sido absorbidos por un material.

Espectrofotometría: es un método físico que permite detectar un compuesto en disolución, o determinar su concentración aprovechando el comportamiento de éste frente a luz, ya sea en el espectro visible o ultravioleta.

Longitud de onda max: sirve para realizar la curva de calibración, cada cromóforo va a tener su propia lamda máximo que se va a indiciar como un pick

El Max de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible (lamda máximo).

El lamda max se determina para conocer a que lamda dicho compuesto tiene su max absorción

Factor de calibración: es una manera de conocer la concentración de una muestra problema, en este caso las proteínas FC = (X + C)/Y

Condiciones para la ley de Lambert-beer

La ley de Lambert-Beer se cumple para disoluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.

De la ley de Lambert-Beer vemos que la absorbancia a una  dada aumenta en forma lineal con la concentración de la solución.

Curva de Calibración del Método de Calcio:

Por lo tanto, interpolando la absorbancia de la muestra problema, sabemos que

tiene una concentración de 12.5 mg de calcio/dl. Ahora, también lo podemos

calcular por la ecuación de la recta:

Y = bX + a

Donde, Y es la absorbancia de la muestra problema, b es la pendiente, x es la

concentración desconocida de calcio y a es el intercepto:

Y = 0.04X + 0

Por lo tanto, la concentración de la muestra problema es de 12,5 mg/dl

Ahora, si solo consideramos una sola concentración utilizada en la curva de

calibración, por ejemplo 10 mg/dl, y calculamos la concentración de calcio de la

muestra problema por una regla de tres, debemos obtener el mismo resultado que

interpolando en la recta o por ecuación de la recta:

Si 10 mg/dl 0,4

X 0,5

De la ecuación de la recta, se puede extraer el factor de calibración (FC):

FC = (X + C)/Y

Donde X es el promedio de las concentraciones de estándares, Y es el promedio de

sus absorbancias y C es a/b, y se interpreta como el error de la curva de calibrado

(idealmente igual a 0). Este FC, se multiplica por la absorbancia de la muestra

problema y así conoceremos la concentración de calcio:

FC = 12,5 mg/dl + 0 25 mg/dl

0,5

FC x Absorbancia muestra problema: 25 mg/dl x 0,5 = 12,5 mg/dl

Procedimiento experimental

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