BIOPROCESOS

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571

RESUMEN

Hemos desarrollado el cultivo celular de la cepa KluyveromycesMarxianus NRRL Y-7571 realizando su manipulación desde su estado inactiva en agar. El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales tales como activación en estufa, inoculación en agar, dándole todas las condiciones y facilidades para que pueda crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico (30ml), el cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere para su óptimo desarrollo.

Luego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido dentro de otro medio al que se denomina mínimo (300 ml) por sus limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue Fructosa.

Se trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular con los nutrientes exactamente necesarios para tal acción y al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en este caso principalmente la fructosa. Y esto es posible determinar haciendo evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia (640 nm en el espectrofotómetro) y el ensayo con reactivo DNS para el caso del sustrato con una absorbancia de 540 nm en el espectrofotómetro y la generación de productos como el etanol el cual será medido mediante CG (cromatografía de gases) usando como factor externo n-propanol.

Se obtuvo un rendimiento promedio de: biomasa de 0,237 g/g glucosa. A partir de la biomasa obtenida se pudieron obtener los parámetros cinéticos los cuales fueron un max = 0,225 hr-1, YP/S =1,736 x 10-3 g de Etanol/g de Fructosa, QX/S = 0,056 g de Biomasa/hora.

INTRODUCCION

En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y exactos sobre la velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado.

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.

Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de un microorganismo (KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571), iniciando desde su siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico, empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rápida activación, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo; es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la cinética de crecimiento.

Dentro de su importancia en la agroindustria la KluyveromycesMarxianusNRRL Y-757 1es muy valiosa para la conversión de fructosa en etanol que puede mejorar la economía de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. Con la conversión de la fructosa, la potencial reducción del precio está en función de tres parámetros de fermentación: el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad. Asumiendo altos valores para estos parámetros, la reducción máxima puede volverse de 40%. Hoy en día es conocido que un número de levaduras fermenta fructosa en etanol, siendo KluyveromycesMarxianusde las más eficientes, especialmente en relación con el rendimiento y la proporción volumétrica. Empleando esta levadura para la fermentación de la D-xilosa, la reducción en el precio del etanol alcanza el 70% del máximo asequible.

KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571es una de las mejores cepas de levadura natural capaz de convertir el azúcar hexosa, fructosa, en etanol. Para desarrollar una más eficiente pentosa en el proceso de fermentación, la nutrición se basa en estrategias para mejorar la vitalidad de levadura y la fermentación se exploró la eficiencia mediante el estudio de variadas culturas en nutrientes tales como: aminoácidos, urea, vitaminas, y minerales.

A. CULTIVO POR LOTES

La fermentación por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente desinfectados antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final. Los únicos materiales extraídos y agregados durante el curso de una fermentación por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. En este modo de funcionamiento, las condiciones están cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado inestable.

La ventaja principal es el menor riesgo de contaminación con respecto a otros procesos de fermentación (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado.

La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre lotes, comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza, esterilización y procesos de salida. Otra desventaja es la inhibición del crecimiento por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes.

B. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

Si el microorganismo crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres.

En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase latencia o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.

4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.

C. FACTORES FISICOQUÍMICOS QUE AFECTAN LA RAPIDEZ DE CRECIMIENTO.

Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento

Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde pH=2 para los acidófilos hasta pH=11 para alcalófilos. En general los microorganismos que toleran pH ácidos no toleran pH alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer cuál es el pH óptimo para el crecimiento. En la fig. 11 está representada en forma general la variación de un con el pH para hongos y bacterias. De la misma surge claramente que en general los hongos tienen un pH óptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; además debido a la forma "achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del óptimo no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente haciéndolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en las medias sustancias que actúen como tampón (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del óptimo.

El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción. Esto se traduce en un aumento de pH con la temperatura.

Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de un decrece rápidamente. La temperatura óptima resulta de la interacción de estos dos efectos.

La temperatura:

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