BIologia Molecular

Comparación de métodos de extracción de ADN de sangre para detectar ADN fúngico por PCR

V. M. Jewtuchowicz*, J. L. Finquelievich , E. Durán, M. T. Mujica, C. A. Iovannitti

Centro de Micología, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Paraguay 2155 (1121) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

*Correspondencia. E-mail: minivirj@hotmail.com

RESUMEN

La infección fúngica invasora (IFI) está asociada a un alto índice de mortalidad, que alcanza el 50% debido a la frecuente falla en el tratamiento antifúngico. Existen dificultades para realizar un diagnóstico micológico rápido y certero dada la baja sensibilidad de los métodos convencionales, especialmente en pacientes neutropénicos y con SIDA. Numerosos métodos para diagnosticar infecciones micóticas basados en el estudio del ADN fúngico están actualmente en desarrollo. Nosotros evaluamos la utilidad de dos procedimientos de extracción y purificación del ADN fúngico presente en sangre para su posterior detección por PCR. Ambos métodos resultaron igualmente eficientes para obtener ADNs de óptima calidad y para realizar la técnica de PCR con los iniciadores universales para hongos ITS 1 e ITS 4.

Palabras claves: ADN fúngico, PCR, Qiagen, tiocianato de guanidina

ABSTRACT

Comparison of different methods of DNA extraction from blood to detect fungal DNA by PCR. Invasive fungal infections (IFI) are associated with high mortality by reaching levels of 50%, and also with a significant failure in antifungical treatments. This fact mostly obeys to difficulties in obtaining a fast and accurate mycologic diagnosis due to the low sensitivity of conventional methods, mainly in neutropenic and AIDS patients. Various methods based on fungal DNA study are currently being used for the diagnosis of mycotic infections. We herein evaluated two procedures of extraction and purification of fungal DNA in blood for their use in PCR detection. Both of them showed equal efficiency in obtaining high performance DNA with universal primers ITS 1and ITS 4 as target.

Key words: fungal DNA, PCR, Qiagen, guanidine thiocyanate

En la última década, las infecciones fúngicas invasoras (IFI) han mostrado un importante incremento en frecuencia y complejidad. Los pacientes con compromiso inmunológico y aquellos que requieren cuidados especiales a causa de su situación crítica se han convertido en los huéspedes con mayor predisposición hacia este tipo de infecciones. La mortalidad relacionada con IFI se ha mantenido muy elevada; así, la vinculada a candidemia es del 40 al 60% (1) y la ligada a aspergilosis invasora superior al 50% (4).

En los pacientes con sospecha de IFI el diagnóstico rápido y certero es muy importante, ya que el inicio temprano del tratamiento antifúngico está relacionado con la disminución de la mortalidad (8). En las IFI, los métodos tradicionales de diagnóstico micológico (histológico, microscópico y cultivo) presentan muy baja sensibilidad y requieren un tiempo prolongado para obtener los resultados (2, 12). Por otra parte, la reciente introducción de nuevos antifúngicos con diferente espectro de acción (azólicos, equinocandinas) hace imprescindible identificar a nivel de especie, objetivo difícil y laborioso de lograr mediante estudios microscópicos y bioquímicos.

Los métodos basados en la amplificación de ADN que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) muestran un gran potencial como herramienta diagnóstica (2, 13, 15). En uno de los primeros estudios prospectivos en 84 pacientes con transplante de médula ósea, Herbart et al. (4) demostraron que la PCR positiva precedía, en promedio, en dos días a la aparición de los signos clínicos de IFI.

El procedimiento de extracción de ADN a partir de muestras biológicas tiene un impacto significativo sobre la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba de diagnóstico molecular (3, 5). Por ello es de vital importancia estandardizar previamente la metodología con modelos experimentales, para luego proceder a realizarlos sobre las muestras clínicas.

El objetivo de este trabajo fue evaluar dos métodos de extracción de ADN a partir de muestras de sangre para su posterior empleo en la detección de ADN fúngico mediante PCR. Para ello, se utilizó el equipo estandardizado comercial QIAamp™ DNA blood Mini Kit (Qiagen AG, Basel, Switzerland) y un protocolo convencional no comercial que utiliza tiocianato de guanidina como agente lítico.

Las muestras de sangre tomadas se colocaron en tubos estériles con EDTA (1,6 mg/ml) (12). Sangre de dadores sanos (mezcla de 30 individuos) fue inoculada con diferentes diluciones de Candida albicans ATCC 90028 (1-104 UFC/ml) o Candida parapsilosis ATCC 22019 (1-104 UFC/ml). Cada dilución fue dividida en dos alícuotas, una para determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC/ml) usando el medio agar Sabouraud glucosado (Laboratorios Britania) y la otra para la obtención de ADN. Como control negativo se usó sangre de diez dadores sanos sin inocular. En este estudio se incluyeron las muestras de sangre de cuatro pacientes con candidiasis sistémica documentada por cultivo, uno de ellos también con aspergilosis invasora probada. La extracción del ADN se realizó mediante dos procedimientos. El primero de ellos, no comercial, se basó en la técnica de Sandhu et al. (10), que usa una mezcla de tio-cianato de guanidina, fenol alcalinizado en buffer Tris (pH 8) e incubación a ebullición para lograr la lisis celular. El otro procedimiento empleado fue un equipo comercial estandardizado para la extracción y purificación de ADN, el QIAamp™ DNA blood Mini Kit (Qiagen AG, Basel, Switzerland), según las indicaciones del fabricante.

La extracción de ADN de las cepas C. albicans ATCC 90028 y C. parapsilosis ATCC 22019 (utilizadas como controles positivos en la PCR) se efectuó con la técnica de Scherer et al. (11). Como control de A. fumigatus se utilizó una cepa obtenida de la colección del Centro de Micología y cuyo ADN se obtuvo por un procedimiento utilizado previamente por Yamakami et al. (15). Los ADNs se conservaron a -20 ºC en buffer TE (Tris 10 mM –EDTA 1 mM).

La integridad de los ADNs fue verificada por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, a 4 voltios/cm. Después de la electroforesis, el gel fue coloreado con bromuro de etidio (0,5 μg/μl) durante 20 a 30 minutos y observado en un transiluminador UV (EPI-Chemi Darkroom. UVP, Laboratory Products). La determinación de pureza y cantidad del ADN extraído se efectuó en

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