CRIMINOLOGÍA, CRIMINALÍSTICA Y TÉCNICAS PERICIALES.

Ciclo escolar 2015 - 2016

LICENCIATURA EN

CRIMINOLOGÍA, CRIMINALÍSTICA Y TÉCNICAS PERICIALES

Genética Forense

Semestre

9°

[pic 2]

ELABORADO POR JOSE ERNESTO GONZALEZ FLORES

DOCENTE: DR. JOSE DE JESUS TOSCANO.

  PRACTICA NO. 5

                                                                                        FECHA (S):

                                                                                        HORARIOS:

TÍTULO DE LA PRÁCTICA:

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

JUSTIFICACIÓN FORENSE:

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: 

El alumno conocerá el proceso de separación de fragmentos de adn por la técnica de electroforesis en geles de agarosa y concluirá prácticas 3 y 4.

COMPETENCIAS A DESARROLLAR CON LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA:

Que el alumno conozca los instrumentos comunes en un laboratorio de genética forense, que el alumno reconozca el proceso de electroforesis de los fragmentos por enzimas de restricción en la identificación de individuos y aprenda a interpretar los resultados que esta técnica nos da.

MATERIAL A UTILIZAR POR PARTE DE LOS LABORATORIOS:

Necesario presentarse con lo siguiente para que se le permita el acceso a laboratorio:

Equipo de seguridad:    

1.- Bata cerrada…..……..                                      [pic 3]

2.- Cubre bocas…………..                                      [pic 4]

3.- Guantes…...                                      [pic 5]

4.- Cabello recogido…….                                      [pic 6]

5.- Lentes de seguridad.                                      

6.- Gorro………………….

7.-Bitacora………………[pic 7]

8.- Botas………………….

ÁREA O INSTALACIONES QUE REQUIERE PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA:

FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS

La electroforesis en gel de agarosa sepáralos fragmentos de ADN previamente digerido por una enzima de restricción o amplificados mediante PCR por tamaño, cargados previamente en un gel, el cual se coloca en una cámara llena de un búfer conductor de electricidad, que forma parte del kit Biotechnology Explorer™Forensic DNA Fingerprinting Kit™ DE LA MARCA COMERCIAL BIORAD™

Una corriente continuase hace pasar entre los electrodos de alambreen cada extremo de la
cámara. Dado que los fragmentos de ADN tienen una carga negativa, ellos serán atraídos hacia el polo positivo (ánodo) cuando se coloca en un campo eléctrico. El gel de agarosa actúa como un tamiz (malla) molecular a través del cual los fragmentos de ADN más pequeños pueden moverse más fácilmente que los más grandes, por lo tanto, la velocidad a la que un fragmento de ADN que migra a través del geles inversamente proporcional a su tamaño en pares de bases. Por lo tanto, los fragmentos de ADN más pequeños viajarán más lejos que los grandes. Fragmentos del mismo tamaño, migran juntos. Estas bandas se pueden ver en el gel después de que se tiñó el ADN.

El ADN es incoloro, así fragmentos de ADN en el gel no se pueden ver durante la electroforesis hasta ser teñido.

Un búfer (tampón) de carga que contiene dos tintes color azul, se añade a las muestras de ADN y hace que sea más fácil descargarlas muestras, así como permitir el monitoreo del progreso de la electroforesis de ADN. Los colorantes migran hacia el polo positivo al igual que los fragmentos de ADN. La tinción del ADN señala su ubicación en el gel. Cuando el gel se sumerge en la solución de tinción, el ADN se “pinta”, y hace las bandas visibles , los estudiantes pueden compararlos patrones de restricción de ADN de las diferentes muestras de ADN.

La siguiente imagen muestra un gel similar al que obtendrán los estudiantes en la práctica de digestión.

[pic 8]

Para la práctica de PCR obtendrá solo dos tipos de bandas: 1 de 400 pb u otra de 100 pb ya sea en estado heterocigoto u homocigoto.

Por convención, los carriles se numeran de arriba a la izquierda. El estudiante se dará a la tarea de observar los patrones de bandas de ADN y ver si alguno de los sospechosos bandas coincida con los del ADN encontrado en la escena del crimen. Tanto con la digestión con enzimas de restricción y con el amplificado por PCR.

MATERIAL NECESARIO PARA LA PRÁCTICA.

PAQUETE Biotechnology Explorer™

Forensic DNA Fingerprinting Kit™ DE LA MARCA COMERCIAL BIORAD™

Sistema de electroforesis en gel de agarosa1❑
Gel de agarosa1❑
Muestras de ADN digeridas, obtenidas en la práctica 2, (6)❑

Muestras de ADN amplificadas, obtenidas en práctica 4
Gradilla para tubos demicro-centrífuga1❑

Gradilla para tubos de PCR
Tinte muestra de ADN de carga 1❑
Marcador permanente1❑

Puntas de pipeta, 2-20µl (microlitros) 13❑

Micropipeta ajustable, 2-20µl 1❑
Película de soporte del gel(si corresponde) 1❑
Charola de tinción (si aplica) *1❑
Espuma microsoporte de tubos de ensayo1❑
Fuente de poder BIORAD™ 1❑
Bandeja de tinción del gel de1 por2estaciones❑
Tampón de electroforesis(TAE 1x) 275ml por ❑estación
Estación de trabajo común
material
Microcentrífuga BIORAD™1❑
o minicentrífuga(opcional) 4❑

Baño María 1❑

Matraz erlenmeyerde200ml1❑

PROCEDIMIENTOS DE LA PRÁCTICA DE ELECTROFORESIS

1.- PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA.

La concentración de agaros a recomendada para geles en esta aplicación es el 1%.Esta concentración proporciona buena resolución y minimiza el tiempo de ejecución requerido para la separación electroforética de fragmentos de ADN.
El espesor recomendado para el gel es 0,75 a 1,0cmpara facilitar la muestra carga y manipulación del gel. Asegúrese de usar búfer (tampón) TAE(Tris-acetato-EDTA)de electroforesis para preparar el gel de agarosa.

2.-Preparaciónde agarosa. Para hacer una solución de agarosa al1%, usar1gramo de agarosa por cada100ml debúfer1xTAEde electro foresis ¡Asegúrese de usar tampón de electroforesis, no agua! Para un gel de 7 x 7 cm, se requieren 40 ml de preparación de agarosa
3.- Se requiere un peine de 8 dientes para hacer los pocillos en el gel, donde será cargado el ADN obtenido previamente de la práctica número 2.

4.- Se colocará otro peine para hacer los pocillos en el gel donde será cargada la amplificación obtenida previamente en la práctica 4.

...