Cultivo De Microorganismos: Preparación De Medios De Cultivo. Siembras, Repiques Y Aislamiento.

Trabajo Práctico de Laboratorio N°2

Parte “A”: Cultivo de microorganismos: Preparación de medios de cultivo. Siembras, repiques y aislamiento.

Material a preparar por el alumno:

Tubos con medio sólido estéril (Pico de flauta y Recto) y Placas

Medio de cultivos comerciales: YGM y Agar Sabouraud Glucosa.

Composición Agar Sabouraud Glucosa (g/l)

Pluripeptona 10

Glucosa 40

Cloranfenicol 0,05

Agar 15

pH: 5,6 ± 0,2 a 25 °C

Composición de YGM (yeast glucose médium)

Extracto de levadura 0,5 g

Glucosa 1 g

Agar-Agar 2 g

Agua Destilada 100 mL

1º) PREPARACIÓN DE MEDIOS

1. Pesar 6,5 g del polvo Agar Sabouraud Glucosa, colocarlo en un erlenmeyer y adicionar 100 ml de agua destilada, agitar hasta homogeneizar. Para el medio de cultivo YGM se procede de igual manera que en el anterior pero, en este caso, se deben colocar los cuatro ingredientes por separado y previamente pesados, incluida el agua.

2. Colocar un tapón de tela de guata a cada erlenmeyer y esterilizarlos en el autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

3. Dejar enfriar y conservarlos en la heladera hasta su uso.

4. Calentar el medio en el microondas hasta que se funda completamente.

5. Distribuir los medios rápidamente, antes de que comience a solidificar, en las placas de Petri y en los tubos de ensayo, previamente esterilizados, dentro de la zona de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. Los tubos no se deben llenar más de un tercio de su volumen.

6. Dejar que los medios solidifiquen, en forma inclinada para el caso del tubo pico de flauta y verticalmente para el tubo recto. Una de las placas se deja a la intemperie para la posterior comparación con las demás placas, las cuales permanecen en un medio estéril.

2º) REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA

1. Tomar una muestra de tierra y colocarla en suspensión acuosa.

2. Realizar la siembra.

Siembra en placa:

Se divide la placa en dos partes, sembrar en cada mitad la muestra. Se introduce el ansa de anillo en el vaso que contiene la muestra y se toma una gota que se extiende sobre la placa deslizando el ansa suavemente por su superficie formando estrías muy juntas. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas bacterias originará una colonia. Flamear el ansa y cerrar la placa e incubar.

Siembra en tubos:

A partir de un cultivo crecido se toma con el ansa una pequeña porción que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el ansa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso de tubos rectos, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis). Se siembra la muestra de tierra utilizando el ansa recto, realizando una punción.

3º) INCUBACIÓN de los medios sembrados a 28 ºC durante 48 hs hasta que haya habido crecimiento microbiano.

4º) OBSERVACIÓN al microscopio de los cultivos crecidos.

Resultados obtenidos

La placa expuesta a la intemperie se encontraba muy contaminada con microrganismos ambientales. La placa con el medio sin sembrar no presentaba crecimiento microbiano lo que demuestra que el ambiente de trabajo estaba bien esterilizado. En algunas de las demás placas el crecimiento de colonias de mohos fue superior al de bacterias y levaduras, llegando a ocupar todo el espacio de las placas, debido a que el tiempo de incubación supero las 48 hs. En las tubos pico de flauta el Aspergillus niger sembrado creció favorablemente, mientras que en las tubos rectos hubo

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