MANUAL DE QUIMICA FORENSE

Sobre este efecto particular, se postulan dos causas probables:

- Se atribuye a diferencias en las características superficiales del plástico que exhiben los pocillos situados en sectores diferentes de la placa, derivadas de la influencia variable de la temperatura en el moldeo, el sistema de enfriamiento, etcétera.

- Existe un gradiente término durante el proceso de incubación. Como el poliestireno es un conductor término pobre, un gradiente térmico se instauraría entre pocillos externos e internos, si la incubación dura poco tiempo. Este efecto se anularía, si se incuba con circulación forzada de aire o preincubando placa y solución de inmunorreactante previo al llenado de los pocillos.

Dentro de los inmunoensayos no competitivos con antígeno inmovilizado en fase sólida, se distinguen tres métodos generales: directo, indirecto y ensayo puente.

El ensayo directo es el menos utilizado en investigaciones cuantitativas, pero es frecuente su aplicación en test cualitativos. El antígeno inmovilizado reacciona directamente con el anticuerpo agregado y presenta como ventaja una menor cantidad de etapas y controles, si bien es mayor el consumo de reactantes.

Técnica operatoria del método directo

ETAPA I: Inmovilización. Se induce la adsorción no covalente de residuos de mebranas eritrocitarías desintegradas a policubetas de poliestireno, facilitando la inmovilización por exposición simultánea del material a pH francamente alcalino (solución amoniacal) y temperatura.

Se sistematizan las cubetas por pares, un pocillo para evaluar aglutinógeno A y el otro para el B. los hilos de gasa con material procedente de las manchas a analizar se depositan en las cubetas, las que se cargan con solución de amoníaco al 5% v/v, hasta 2/3 de su capacidad.

Se maceran los hilos en la solución con el auxilio de un capilar obturado en su extremo superior hasta obtener en la cubeta una coloración homogénea, variable entre el amarillo-castaño y el rojo-castaño, según el grado de impregnación que presenten los hilos antes de la prueba.

Se retiran los hilos con pinza tipo odontológica, lavando ésta antes de cambiar de pocillo.

El sistema se incuba en estufa de esterilización a 70°C durante 15 minutos, directamente exponiendo las cubetas sin cámara húmeda.

Transcurrido ese lapso, se reacondiciona la estufa a 62°C y se reincuba por 20 minutos más, en las mismas condiciones.

ETAPAII: Lavado. Para eliminación de material no fijado y para remoción de partículas débilmente adsorbidas. En ningún caso los lavados serán enérgicos, simplemente consisten en la sumersión de las policubetas en la solución de lavado, leve agitación para eliminar burbujas de aire que queden retenidas en el interior de alguna cubeta, dejando luego el sistema en reposo.

La solución de lavado es cloruro de sodio 0,15 molar (o solución fisiológica) y el tiempo es de 2 minutos.

ETAPA III: Absorción de anticuerpos. Contacto con los sueros hemoclafisicadores especificidad anti A y anti B, puros o diluidos 1:2. Las cubetas se cargan hasta 2/3 de su capacidad. Se mantiene el sistema a 4°C por el lapso de 40 minutos (en heladera y en cámara húmeda).

En los ELISA clásicos, previo al agregado de los antisuero se procede a bloquear todos los sitios activos remanentes de la matriz sólida (no ocupados por el antígeno en la etapa de inmovilización), ya que pueden adsorber fracciones proteicas inespecíficamente (anticuerpos del antisuero), interfiriendo el ensayo.

Para el bloqueo se contacta la superficie del plástico (ya revestida parcialmente con los fragmentos de membrana eritrocitaria) con una proteína inerte del tipo gelatina, caseína, albúmina bovina, suero humano, hemoglobina, etc. En nuestro caso, la hemoglobina presente en los macerados de manchas de sangre es la que actuará, en competencia con el antígeno, desde el inicio de la fase de fijación.

ETAPA IV: Lavados. Eliminación de los anticuerpos no absorbidos por el material antigénico fijado al plástico.

Se operan dos lavados consecutivos con idénticas consideraciones a las apuntadas para la ETAPA II.

Ambos lavados se practican con solución de cloruro de sodio 0,15 M (o solución fisiológica) durante 5 minutos.

ETAPA V: Elusión. Agregado de suspensiones al 2% de glóbulos rojos grupo “A” y “B” (los pocillos se cargan hasta 2/3 de su capacidad) e incubación del sistema a 55°C durante 15 minutos.

Esta temperatura y tiempo son marcadamente críticos.

ETAPA VI: Aglutinación. Agitación de las policubetas en agitador mecánico orbital durante 15 a 20 minutos. Este procedimiento no debe ser enérgico, por cuanto si las revoluciones son muy elevadas se desorbe el revestimiento de la superficie plástica, generando agregados inespecíficos que decantan y se pueden interpretar como grumos específicos de aglutinación.

La agitación facilita el contacto entre los anticuerpos eludios de su unión a los antígenos inmovilizados en fase sólida y los aglutinógenos de los eritrocitos presentes en las suspensiones.

ETAPA VII: Observación microscópica. Se resuspende con micropipeta el depósito de glóbulos rojos en el contenido de cada pocillo por aspiración suave, sin tocar el fondo ni las paredes de las cubetas; de lo contrario se desprende el revestimiento induciendo a error, según lo ya expresado. Se deposita una gota del contenido de cada pocillo con material ya resuspendido en portaobjetos y se investiga la presencia de aglutinación con objetivo de 10X.

Capítulo III

ANÁLISIS DE SEMEN

1. Introducción

Uno de los temas químicos forenses de rutina, lo constituye la investigación de la presencia de semen en los casos de denuncias por delitos sexuales.

En tales casos, siempre es relevante el informe médico realizado sobre la víctima, ya que la sola presencia de semen en la misma o en los objetos secuestrados en la causa no demuestra delito, sino tan sólo la realización del acto, igualmente la ausencia del indicio buscado no descarta la violencia, el abuso deshonesto o el acceso carnal, sino tan sólo la falta de eyaculación por parte del autor (aunque no se debe descartar el uso y eliminación posterior de preservativo).

En los delitos sexuales de cualquier tipo, el primer objeto de estudio para los investigadores es la víctima. El acto delictivo se realizó sobre ella y sólo se puede probar sobre ella. Es decir que el hallazgo de elementos seminales en objetos presentes en el lugar del hecho, en prendas, en camas, etc., no demuestra el ejercicio de violencia que requiere el acto sexual para constituirse en acto delictivo. De allí la importancia de la inmediatez entre el hecho, la denuncia y la revisación médica de la víctima.

Del mismo modo, es necesario instruir inmediatamente a las víctimas de delitos sexuales, sobre la necesidad de no bañarse o lavarse, no lavar las ropas, no cambiar las ropas de cama ni realizar ningún acto que destruya pruebas, lo que a veces resulta difícil, ya que por lo general, el primer acto al que tiende la víctima es a borrar todas las huellas del agresor sobre su persona mediante un concienzudo baño.

La presencia de semen en los objetos investigados queda categóricamente demostrada cuando fue posible hallar en el material examinado al menos un espermatozoide entero, y en caso de que este hallazgo sea negativo, la presencia de fosfatasa ácida prostática, presente en alta concentración en el material seminal.

Algunos autores proponen la búsqueda alternativa de colina o espermina, aunque estos análisis no se aplican de rutina, y varios laboratorios han optado por el análisis de antígeno prostático.

2. Muestras

Los estudios que nos ocupan se realizan sobre distintos medios que obligan al muestreo adecuado en cada caso, para asegurar su hallazgo, motivo por el cual a continuación se detallan las operaciones a realizar para cada tipo de muestra.

a) La víctima.- A los efecto de investigar la presencia de semen sobre la víctima de violación, es necesario hacer hincapié en que la toma de muestra debe ser realizada exclusivamente por un médico, ya que el correcto muestreo requiere la colocación de un espéculo para asegurar la toma de fondo de saco vaginal, donde el material seminal queda retenido aun cuando la víctima, instintivamente, se haya higienizado luego del hecho. La necesidad de la participación del médico viene dada porque es él quien debe decidir sobre la factibilidad de la colocación de espéculo, ya que cuando se trata de víctimas menos o cuando haya habido penetración parcial sin desfloración, o cuando la penetración ha provocado serias heridas, es el médico quien puede evaluar si tal operación es factible, sin provocar una desfloración indeseada que pueda ser luego denunciada como lesiones, ahondar el grado de las mismas o el shock psicológico que sufre la víctima.

Una vez colocado el espéculo, cuando ello es posible, el médico deberá tomar la muestra con hisopo de algodón introducido hasta el fondo del saco vaginal, y realizar un extendido con el hisopo sobre un portaobjetos, el que será tapado con otro portaobjetos y convenientemente unidos los mismo con cinta engomada remitidos al laboratorio para su observación microscópica directa o con previa coloración. No se debe colocar el portaobjetos en ningún líquido de conservación, sino remitir en forma inmediata, y hasta su observación mantener en frió de heladera. El hisopo, luego del extendido, deberá ser colocado en el interior de un tubo con cierre hermético, sin ningún medio conservante y reservado en freezer para permitir el análisis de fosfatasa ácida prostática. El muestreo ideal

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