Nombre del trabajo: Reporte 7 de laboratorio: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de un producto de DNA para su clonación
Enviado por GabrielGarc8840 • 14 de Marzo de 2017 • Resúmenes • 1.388 Palabras (6 Páginas) • 284 Visitas
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON[pic 4]
Facultad de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biotecnología Genómica
Nombre de la Materia: “Técnicas Básicas de Manipulación de Ácidos Nucléicos”
Nombre del trabajo: Reporte 7 de laboratorio: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de un producto de DNA para su clonación
Nombre del Alumno: Aquino Rivera Ana Victoria
Grupo: 443
Fecha de entrega: Monterrey, N.L. a 16 de abril del 2015
Introducción
La PCR como sus sigas lo indican reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica para la amplificación de moléculas de ADN que ha introducido una verdadera evolución a la tecnología del ADN y sus aplicaciones permitiendo su generalización a multitud de disciplinas, el fundamento de la PCR se basa en en el uso de oligonucleótidos que actúan como cebadores situados en las proximidades de la secuencia diana que se quiere amplificar en cada una de las hebras complementarias, las cuales han sido previamente, separadas. Asi cada filamento completa el resto de la cadena a partir del cebador, gracias a la acción del la ADN polimerasa. Se inicia cada ciclo de separación de los filamentos de ADN por calentamiento seguidamente se añaden los oligonucleótidos cebadores diseñados para que se situen en posiciones adyacentes a la secuencia que se quiere amplificar y se enfria para permitir que estos se acoplen adecuadamente. Además, se han diseñado PCR más específicas que se pueden elegir según sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, además de la básica, son:
- PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos.
- PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.
- PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y con una sola muestra.
- PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre otros virus.
- PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado.
Objetivo:
Caracterizar un plásmido recombinante a a través de los productos ampliaciones producidos
Condiciones de PCR:
- Temperatura 1= desnaturalización, Lización: 94ºC por 2 minutos
- Temperatura= desnaturalización 94º C por 1 minuto
- Temperatura= alineamiento (AOX 54º C) por 1 minuto
- Temperatura= polimerización a 72 ºC por 1 minuto
- Se repiten los pasos 2,3 y 4 por 30 veces
- Temperatura de polimerización 72º C durante 10 minutos
PCR:
H2O | 18.25 µl | 7.3 µl |
10 X | 2.5 µl | 10 µl |
Mg | 0.75 µl | 3 µl |
Dntp´S | 0.5 µl | 2 µl |
Forward | 0.5 µl | 2 µl |
Reverse | 0.5 µl | 2µl |
Taq Pol | 1 µl | 4 µl |
DNA Molde | 1 µl | 4µl |
Equipo 1: Primer
- Forward E7
- Reverse E7
Equipo 2: Primer
- Forward D1
- Reverse D1
Equipo 3: Primer AOX
- AOX 1
- AOX 2
Equipo 4: Primer
- Forward E7
- Reverse D1
Resultados y anotaciones
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Carril | Muestra |
11 | Navarro |
12 | Olivares |
13 | Rivera |
14 | Rodriguez B. |
15 | Rodríguez |
Carril | Muestra |
1 | nada |
2 | Aquino |
3 | Diaz |
4 | Fuentes |
5 | Galán |
Carril | Muestra |
6 | García |
7 | Leader 100 |
8 | González |
9 | Hernandez |
10 | Loera |
Discusion
Analizando los resultados obtenidos en los carriles de nuestro gel, podemos observar que cada primer tuvo una función muy especifica de amplificación de los sistemas en donde se encontraban nuestros plasmidos recombinantes con el inserto que se ha estado trabajando, con lo cual algunos funcionaron de mejor manera que otros para lograr unirse a la secuencia y poder amplificar de mejor manera. En nuestro caso ( el equipo 3) al manejar el primer AOX 1 y 2 no logra distinguirse de manera clara en nuestros carriles de elctroforesis, por lo cual no logra amplificar tanto a comparación de los otros primers utilizados, por lo tanto es importante resaltar la selección de los primers a utilizar y la afinidad que estos puedan tener para poder caracterizar el inserto en el plasmido PGEMT, en nuestros carriles no se logra ver mucho los plasmidos recombinantes con el inserto
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