Pcr Reporte De Laboratorio

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa permite replicar entre cientos de miles y millones de veces un fragmento de DNA en el transcurso de pocas horas e in vitro. Esta metodología tiene aportes fundamentales para la investigación básica de la Biología Molecular, esta consiste en la rapidez y eficiencia ante la realización de unas pruebas y ensayos, puesto que antes requería largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción del PCR es una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza, otorgando amplia información de la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde. El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización, hibridación y elongación. En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se conoce como hibridación. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC. Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC. Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR.

Antecedentes

La PCR ocurrió en 1983, cuando Kary Mullis desarrollo una nueva técnica que hizo posible la síntesis de grandes cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en ingles). Esta técnica es considerada la más revolucionaria del último cuarto del siglo. Con esta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan solo una diezmillonésima parte. La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de este es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN. La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades de un cierto ADN específico, posibilitando su fácil identificación y prescindiendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención.

Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir la enzima ADN polimerasa, ya que esta se inactivaba con las temperaturas tan altas demandadas para desnaturalizar el ADN y exponer las bases nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconveniente era que había que hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al ˙último, repitiendo esto varias decenas de veces, sin embargo estos problemas se resolvieron con el tiempo.

Hoy en día una PCR se realiza de esta manera, una vez teniendo los tubos listos con todo lo necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con mag-nesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente paso es colocar los tubos en una máquina conocida como termociclador, que básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. Lo que sucede es lo siguiente, el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera es a 95ºC (y a este paso se le llama desnaturalización) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40º y 60ºC (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias) durarán mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. Después la temperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como extensión), ya que 72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima

...