Laboratorio

ANEXO-Laboratorio Nº 1

OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS.

El examen microscópico de microorganismos constituye una de las técnicas características de la microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo.

Para obtener el máximo aprovechamiento de la observación microscópica, debe poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composición química de las diferentes partes de la anatomía bacteriana.

Colorantes y mordientes.

Los colorantes utilizados en Microbiología son compuestos orgánicos que contienen grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos .

La presencia de grupos cromóforos en una molécula (grupos azo, nitro, etc.) no es suficiente para que ésta actúe como colorante, esto es que se fije a las estructuras a colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un colorante. Sin embargo, si se reemplaza un H por un OH en el anillo bencénico, se obtiene el ácido pícrico que también es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo) actúa como colorante.

La distinción entre colorantes ácidos y básicos depende de la carga de la parte de la molécula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante ácido y si es positiva se trata de un colorante básico. Esta diferencia es importante debido a que, según sean ácidos o básicos, los colorantes tendrán afinidad por diferentes zonas de la anatomía celular.

Algunos colorantes utilizados comúnmente en Microbiología son fucsina básica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.

En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan al proceso de coloración: los mordientes. Ejemplos de mordientes comúnmente usados son el Lugol, el ácido tánico y algunas sales.

Lógicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras celulares, sin embargo hay un fenómeno llamado metacromacia en el cual se observa un color diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpúsculos metacromáticos rojos en ciertos preparados teñidos con azul de metileno. Una explicación que da cuenta de este fenómeno se muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianiónicas como los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorción . Pueden observarse corpúsculos metacromáticos (gránulos de volutina) en varios géneros microbianos y en general, su presencia denota algún déficit nutricional en el medio de cultivo.

PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.

a) Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el ansa en forma de óvalo. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobajetos.

b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.

c) Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.

El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.

Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.

Observación en fresco y coloración vital.

Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observación en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluídos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta técnica podrá observarse la morfología y agrupación de las bacterias así como también la movilidad.

Observación en fresco.

Técnica.

1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensión de la muestra en estudio. No extender.

2- Colocar un cubreobjetos.

3- Observar con poca luz.

Coloración vital.

El procedimiento es similar al de la observación en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solución diluída de colorante en lugar del agua.

Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales es posible colocar una mayor cantidad de líquido. Son los portaobjetos de Boettcher y de Ranvier.

Coloración simple.

Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes más utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.

Técnica.

1- Extender, secar y fijar por calor.

2- Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado.

3- Lavar con agua corriente.

4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

Tinción negativa.

Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula y por lo tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medición de microorganismos.

Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa.

Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también estraucturas extracelulares como la cápsula.

Técnica.

1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solución acuosa de nigrosina al 10 %.

2- Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de óvalo.

3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersión.

COLORACIONES ESPECÍFICAS.

Coloración de Gram.

Esta coloración fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1883 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica.

En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) serán las que resulten violetas luego del procedimiento de coloración de Gram mientras que las Gram (-) se verán rojas.

La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana .

La pared de las bacterias Gram (+) está constituída fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglicano (20-30 nm), que es un polímero de N- acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglicano, se unen a través de puentes formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos, formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos pero se hallan anclados a la membrana citoplasmática.

En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglicano es mucho más delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede observarse una representación de las paredes celulares de organismos G(+) y G(-).

Al tratar los preparados con cristal violeta y Lugol, se forman agregados entre el colorante y el mordiente que durante el proceso de decoloración, no pueden ser extraídos de las bacterias Gram (+) debido a la gruesa capa de peptidoglicano. En las bacterias Gram (-), la mezcla decolorante puede atravesar fácilmente la capa de lípidos de la membrana externa y la delgadez de la capa de peptidoglicano presente, permite la extracción de los agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas con fucsina o safranina, las bacterias Gram (-) tomarán el color del contracolorante.

En esta coloración, el paso crítico es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado resultarán decoloradas aún las bacterias Gram (+). Debe tenerse en cuenta asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta fundamental para lograr una buena diferenciación, debe trabajarse en lo posible con cultivos jóvenes.

Es importante mencionar, que la clasificación en Gram (+) y Gram (-) no puede aplicarse a todas las bacterias ya que hay algunas que no pueden colorearse con esta técnica o para las cuales no tiene sentido esta clasificación.

Técnica.

1- Extender, secar y fijar a la llama.

2- Cubrir durante 2 minutos con solución de cristal violeta al 1%.

3- Escurrir y cubrir con solución de Lugol* durante 30 segundos.

4- Escurrir y cubrir nuevamente con Lugol durante 30 segundos.

5- Decolorar con alcohol acetona y lavar con abundante agua.

6- Cubrir con solución diluída de fucsina 0,1 % o safranina 0,5 % durante 2 minutos.

7- Dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

*Lugol: Iodo, 1g; KI, 2g; agua, 300 ml.

Bacilos ácido alcohol resistentes. Coloración de Ziehl - Neelsen.

La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está compuesta por una gran cantidad de lípidos tanto libres como covalentemente unidos: los ácidos micólicos y los micósidos . La alta proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos7. Se utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con ácido-alcohol y una contracoloración con azul de metileno. La mezcla decolorante no podrá extraer el colorante de los BAAR que permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se verán azules.

Entre las bacterias ácido-alcohol resistentes más representativas se encuentran las pertenecientes al género Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiológicos de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta coloración es de suma importancia diagnóstica. Otro género de bacterias que se colorean mediante esta técnica es Actinomyces.

Técnica.

1- Extender, secar y fijar a la llama.

2- Cubrir con solución de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %).

3- Pasar un hisopo de algodón embebido en alcohol por debajo del preparado hasta lograr la emisión de vapores. El preparado debe mantenerse caliente durante 5 minutos pero evitando que se produzca la ebullición del colorante. Por consiguiente, no debe mantenerse el hisopo debajo del preparado sino colocarlo en los momentos en que cese la emisión de vapores.

4- Escurrir y lavar con agua.

5- Decolorar con ácido nítrico diluído 1/3 y luego con alcohol.

6- Lavar, escurrir y cubrir con solución de azul de metileno durante 2 minutos.

7- Lavar con agua, dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

Coloración de esporos.

Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a través de un proceso llamado esporulación. Este proceso de diferenciación, está codificado genéticamente y permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo8. Los géneros de bacterias capaces de esporular hasta ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina por lo cual la presencia de esporos en una bacteria es de gran utilidad taxonómica. Estructuralmente, los esporos bacterianos están rodeados por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El córtex o corteza, está compuesto por un peptidoglicano que contiene menos enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta está formada por una proteína del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es fundamental para la resistencia del esporo a los agentes físicos y químicos. El exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo poseen en su composición química, una alta concentración de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua durante el proceso de esporulación9.

Las características antes apuntadas, dan cuenta de la resistencia de los esporos a los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar.

En todas las técnicas para colorear esporos se utilizan procedimientos drásticos. Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller.

Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se verán los esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear al esporo. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul.

Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se verán incoloros, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporos y debe confirmarse su presencia mediante una coloración específica.

Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporos es su posición: terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria ya que serán características que ayudarán en la clasificación.

Técnica.

a) Método de Dorner.

1- Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de agua destilada.

2- Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.

3- Tomar una ansada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una ansada de una solución acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de óvalo.

4- Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.

b) Método de Moeller.

1-Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol, encendiendo y dejando apagar.

2-Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para sensibilizar.

3-Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10 minutos ( calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores y volver a calentar ocasionalmente para mantener la temperatura).

4-Lavar con agua corriente.

5-Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la decoloración con alcohol.

6-Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.

7-Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

Coloración de flagelos.

Los flagelos bacterianos son apéndices celulares que están asociados a funciones de locomoción. En cuanto a su estructura y composición química, son similares en una gran variedad de bacterias.

Estos apéndices, están unidos a la célula a través de un cuerpo basal conectado a un gancho, que se continúa con un filamento helicoidal. El cuerpo basal está constituido por un cilindro central y 2 ó 4 anillos según se trate de bacterias Gram (+) o Gram (-) respectivamente. Químicamente, el cuerpo basal y el gancho están compuestos por una variedad de polipéptidos pero el filamento está formado por subunidades proteicas de flagelina que se disponen formando una helice alrededor de un centro hueco10.

La coloración de flagelos se realiza fundamentalmente en los casos de bacterias móviles para las cuales la determinación del número y posición de estos apéndices contribuya a su identificación. En la figura se ilustran las diferentes disposiciones encontradas.

Técnica.

1-Colocar todo el material y las soluciones que se van a emplear en la estufa a 37°C por lo menos 90 minutos antes de usarlos.

2-Hacer una suspensión del germen en estudio en agua estéril termostatizada.

3-Hacer el extendido dejando correr una gota de la suspensión a lo largo de un portaobjetos limpio y desengrasado. Hacer por lo menos 3 preparados y dejarlos secar en la estufa.

4-Mezclar dentro del cuarto estufa: 5 ml de alumbre de potasio, 2 ml de solución de ácido tánico y 2 ml de cloruro mercúrico*.

5-Agitar bien y agregar 1- 1.5 ml de Verde de Malaquita 5 %. Mezclar bien y mantener en estufa 2 minutos con agitaciones periódicas.

6-Filtrar de inmediato con papel de filtro plegado y dejar otros 2 minutos.

7-Agitar y colocar sobre los extendidos a razón de alrededor de 2,5 ml por portaobjetos.

8-Dejar actuar la mezcla colorante. Como el tiempo varía según el germen, dejar actuar de 5 a 9 minutos.

9-Lavar con agua destilada termostatizada. Puede utilizarse azul de Loeffler** para colorear el resto de la bacteria. Escurrir, dejar secar y observar con objetivo de inmersión.

* alumbre de potasio (.24 H2 O) 10,5 %; HgCl2 6 %; ácido tánico 20 %.

** azul de metileno 0,3 g, etanol 30 ml, KOH 0,01 g y H2O 100 ml.

Coloración de espirilos.

Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias con morfología helicoidal y un cuerpo bastante rígido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la misma morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos12 . Las espiroquetas están formadas por un cilindro protoplasmático constituido por el citoplasma, la región nuclear, la membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático se halla rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composición intervienen proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y fosfolípidos13.

Alrededor del cilindro protoplasmático se encuentran un número variable de flagelos periplásmicos que, según la especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos.

A diferencia de otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los géneros de bacterias espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema palidum es el agente etiológico de la sífilis), Borrelia y Leptospira.

En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados mediante microscopía óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana-Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una impregnación argéntica con nitrato de plata amoniacal (solución de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En los casos en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con líquido de Rouge (ácido acético- formaldehído-agua). Al aplicar esta técnica de coloración, se verán los microorganismos marrón oscuro sobre fondo amarillento.

Técnica.

1- Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos.

2- Deshemoglobinizar con líquido de Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml).

3- Lavar con agua corriente.

4- Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar inmediatamente.

5- Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisión de vapores. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la solución. 6- Lavar con abundante agua destilada.

7- Cubrir con solución de Fontana* en frío, mover el preparado hasta que tome color castaño claro. Calentar y mantener emisión de vapores durante 15 segundos.

8- Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

*Preparación de la solución de Fontana:

Colocar solución de nitrato de plata al 5 % y agregar, gota a gota, una solución de amoníaco al 5 % hasta opalescencia. Seguir agregando amoníaco hasta clarificación de la solución y finalmente agregar solución de nitrato de plata hasta ligera opalescencia. La solución debe prepararse en el momento de usarse.

Coloración de cápsulas. Técnica de Novelli modificada.

Algunas bacterias son capaces de formar por fuera de la pared celular, una envoltura polimérica llamada cápsula que las protege de la fagocitosis e interviene en fenómenos de adherencia a diversos sustratos. Pueden encontrarse cápsulas de variada composición química: polímeros de glucosa y ácido glucurónico ( Streptococcus pneumoniae), polímeros de ácido D-glutámico (Bacillus anthracis) y polímeros mixtos de proteínas y carbohidratos (Bacillus megaterium)14.

Las cápsulas pueden observarse como un halo alrededor de las bacterias cuando se realizan tinciones negativas con nigrosina o tinta china pero pueden colorearse específicamente. La técnica de Novelli, utiliza un colorante específico para las cápsulas glucídicas que es el Azul Alcián. Para teñir la bacteria se utiliza fucsina. Se verán bacterias teñidas de rojo rodeadas de la zona capsular azul.

Técnica.

1- Hacer un extendido del material sobre un portaobjetos, secar y fijar a la llama.

2- Cubrir con solución de Azul Alcián* durante 2,5 minutos.

3- Lavar y escurrir completamente el agua o, mejor aún, dejar que se seque.

4- Cubrir con solución de fucsina diluida (0,1 %) durante 1 minuto.

5- Lavar y secar.

* Azul Alcián: dilución 1/10 en agua de una solución al 1 % en alcohol.

Coloración de la zona nuclear. Técnica según Robinow.

En las células procarióticas, que no poseen membrana nuclear, el cromosoma constituye la llamada zona nuclear o nucleoide. Al no existir un núcleo propiamente dicho, la basofilia del ARN es tan marcada como la del ADN pues se hallan en idéntico estado de condensación; por lo tanto es necesario eliminar el ARN con la ayuda de una ribonucleasa o aprovechando las diferencias de sensibilidad a la hidrólisis ácida, debidas a las distintas estructuras de estos ácidos nucleicos. Una hidrólisis controlada con ácido clorhídrico 1 N a 60ºC da buenos resultados pero debe evitarse tratamientos muy enérgicos ya que de otra manera se hidrolizaría también el ADN15.

Es conveniente utilizar células en activa división para una mejor visualización.

El extendido se realiza mediante una técnica especial llamada impresión y la fijación se lleva a cabo con vapores de ácido ósmico o sumergiendo el preparado en metanol. El colorante utilizado es el Giemsa y la zona nuclear se ve rojo violáceo.

Técnica.

1- Diseminar sobre la superficie de una caja de Petri con ágar nutritivo, 0,1 ml de un cultivo en caldo de 2 a 8 horas de desarrollo. Este tiempo de incubación depende de la bacteria.

2- Inmediatamente o incubando 3 ó 4 horas en estufa a 37ºC, cortar con un bisturí trozos de ágar de aproximadamente 1 cm2 .

3- Invertir el trozo de ágar sobre un portaobjetos bien limpio y hacer la impronta deslizándolo sobre el mismo. Dejar secar a temperatura ambiente.

4- Fijar el preparado sumergiéndolo en metanol durante 10 minutos o bien sometiéndolo a la acción de vapores de ácido ósmico durante 5 minutos.

5- Hidrolizar el ARN introduciendo el preparado en ácido clorhídrico 1 N a 60ºC durante 8-10 minutos. Sumergir inmediatamente en agua destilada 4 ó 5 veces para evitar que continúe la hidrólisis.

6- Escurrir el agua y cubrir el preparado con una solución de Giemsa diluída 1/100 en buffer fosfato pH 7 . Dejar actuar 15 - 30 minutos (el tiempo depende de la bacteria).

7- Lavar con abundante agua corriente, secar entre dos papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

EL MICROSCOPIO OPTICO.

El tamaño de los organismos objeto de la Microbiología, hace necesaria la utilización de instrumentos apropiados llamados microscopios. Los instrumentos comúnmente empleados son los microscopios ópticos compuestos que constan de un sistema mecánico y un sistema óptico16.

El sistema mecánico está compuesto por diferentes tornillos de ajuste que sirven para enfocar la imagen y obtener una adecuada iluminación.

El sistema óptico está formado por tres series de lentes: condensador, objetivo y ocular.

El condensador hace que la fuente de iluminación proyecte sobre el objeto, un haz de luz adecuado; el objetivo forma una imagen aumentada del objeto que es captada por el ocular que, a su vez, presenta la imagen al ojo del observador. Existen dos características importantes de los sistemas ópticos: el aumento y la resolución.

Se entiende por aumento, a la relación entre el tamaño de la imagen y el del objeto. Para obtener el aumento total, debe multiplicarse el aumento del objetivo por el del ocular.

La resolución es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se distingan separados y está relacionada con la capacidad del sistema óptico de visualizar detalles.

La resolución puede calcularse con la ecuación:

donde k es una constante que depende de la estructura del objeto y de la naturaleza de la luz que lo ilumina. Sus valores oscilan entre 0,5 y 0,8 pero suele tomarse un valor de 0,65,  es la longitud de onda de la luz, n es el índice de refracción del medio en contacto con el objetivo y  es la mitad del ángulo del haz de luz captado por el objetivo. Obviamente para observar detalles deben lograrse pequeños valores de d.

El producto n.sen, se denomina apertura numérica y queda claro que en el aire (n=1), no podrá ser mayor que la unidad. Con el objeto de lograr mejores resoluciones pueden colocarse, entre el objetivo y el objeto, sustancias con índices de refracción mayores que el aire como por ejemplo aceite de cedro.

La resolución quedará determinada entonces no sólo por el objetivo, sino también por el condensador y el diafragma que debe ajustarse de manera de cubrir con luz el campo visual.

Es importante aclarar, que el ocular contribuye al aumento pero no a la resolución ya que es incapaz de mejorar la imagen que le presenta el objetivo.

La iluminación es uno de los puntos claves de toda observación microscópica y debe prestarse atención a su correcto ajuste. El sistema de iluminación que se utiliza actualmente es el de Köhler y consta de una lámpara, una lente frente a la lámpara y un diafragma. También el condensador es parte del sistema de ajuste de la iluminación y posee una lente y un diafragma para regular el paso de luz. En realidad lo importante de este sistema es que, si se regula adecuadamente, se obtiene un campo de observación homogéneamente iluminado aunque sea pequeña e irregular la fuente de luz..

Para regular la iluminación17, primeramente debe enfocarse el diafragma de la lámpara sobre el plano del objeto. Para esto se enfoca un preparado cualquiera y luego se cierra casi totalmente el diafragma de la lámpara manteniendo totalmente abierto el diafragma del condensador. En estas condiciones, se regula la altura del condensador de manera de enfocar nítidamente la imagen de los bordes del diafragma de la lámpara. La posición del condensador así fijada, no debe modificarse a partir de este momento.

Para regular la apertura del diafragma del condensador debe abrirse totalmente el diafragma de la lámpara y cerrarse el del condensador. Posteriormente se quita el ocular y, observando por el tubo del microscopio, se regula la apertura del diafragma del condensador de manera que la lente del objetivo quede cubierta de luz en un 90 %. Finalmente, se coloca el ocular y se cierra el diafragma de la lámpara hasta que la imagen de sus bordes llegue justo hasta el borde del campo visual.

Siguiendo los pasos mencionados, se logrará una correcta iluminación para cada par objetivo-ocular utilizado y se conseguirá un máximo aprovechamiento de la capacidad de resolución de cada objetivo.

Es una práctica muy común, utilizar la altura del condensador y los diferentes diafragmas para regular la intensidad lumínica, sin tener en cuenta que una vez ubicados en la posición correcta no deben moverse pues se modificaría la apertura numérica y por consiguiente la resolución. La intensidad de la luz se debe regular a través de filtros o modificando la potencia de la lámpara.

Enfoque de preparados.

Para la observación de preparados microbiológicos se utilizan normalmente objetivos de inmersión. Los pasos a seguir para enfocar un preparado con este tipo de objetivos son los siguientes:

1) Colocar una gota de aceite de cedro (n=1,5) sobre el preparado.

2) Acercar el objetivo al preparado lo más lo más posible pero observando desde afuera, es decir sin observar por el ocular.

3) Con el tornillo macrométrico y mirando por el ocular, alejar el objetivo del preparado lentamente hasta lograr un enfoque aproximado.

4) Realizar un ajuste fino con el tornillo micrométrico.

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