Revista de publicación: Orphanet Journal of Rare Diseases

Revista de publicación: Orphanet Journal of Rare Diseases

 Año de publicación:01 de diciembre de 2010

Autores:

• Mónica Arenas Hernandez: Laboratorio de Investigación de Purinas. Patología GSTS. Guy's and St. Thomas' Hospitals, Londres, Reino Unido
• Reiner Schulz: Profesor Senior Visitante en Bioinformática y Epigenética, King's College London
• Tracy Chaplin: Laboratorio de Oncología Médica de Cancer Research UK. Barts y la Escuela de Medicina y Odontología de Londres. Queen Mary, Universidad de Londres, Londres, Reino Unido
• Bryan D young: Estudió en la facultad de medicina del suroeste de la Universidad de Texas (2010), sus prácticas y residencia fue en el hospital de Yale-New Haven y tuvo una beca en la universidad de Yale.
• David Perrett: Departamento de Química. Barts y la Escuela de Medicina y Odontología de Londres. Queen Mary, Universidad de Londres, Londres, Reino Unido.
• Michael P Champion: Departamento de Enfermedades Metabólicas Hereditarias. Evelina Children's Hospital, Londres, Reino Unido
• Jan-Willem Taanman:  Departamento de Neurociencias Clínicas. Instituto de Neurología, University College London, Reino Unido
• Anthony Fensom: Centro de Genética. Patología GSTS. Guy's and St. Thomas' Hospitals, Londres, Reino Unido
• Anthony M Marinaki: Laboratorio de Investigación de Purinas. Patología GSTS. Guy's and St. Thomas' Hospitals, Londres, Reino Unido

Lugar donde se realizó la investigación: West Midlands, ubicado en el centro de inglaterra, en el Laboratorio de Investigación de Purina en los Hospitales Guy's  y St Thomas'.

Problema que intentaban solucionar o responder los autores:

Debido al largo proceso de diagnóstico de enfermedades metabólicas hereditarias, los autores buscaban una alternativa de diagnóstico que fuera precisa y temprana, ya que los métodos utilizados para el diagnóstico de estas enfermedades estaban basados en procesos largos y tediosos, los cuales ralentizan el posterior tratamiento eficaz según sea necesario.

Objetivo del trabajo desarrollado: El objetivo de este estudio fué definir las firmas de expresión génica características de las vías metabólicas defectuosas

De qué manera los materiales y métodos ayudaron a cumplir el objetivo y a responder a la pregunta problema:

Aportes significativos de los resultados al sistema de salud o a la profesión de médicos:

Con este estudio, considera que los microarrays aportan en el ámbito clínico para acortar la cascada diagnóstica, es decir, evitar la sucesión de pruebas o técnicas de laboratorio, radiológicas, fisiológicas o biopsias para encontrar una etiqueta diagnóstica que ayude a determinar la presencia o sospecha de una enfermedad metabólica. 

Hoy en día, las micromatrices de ADN se usan en pruebas diagnósticas clínicas para algunas enfermedades. Algunas veces también se usan para determinar qué medicamentos pudieran ser los mejores para recetarse a personas específicas, porque los genes determinan cómo nuestro cuerpo maneja la química relacionada con esos medicamentos.

Microarrays

La tecnología de microarrays es una tecnología en desarrollo para estudiar la expresión de muchos genes a la vez. Consiste en colocar miles de secuencias génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de vidrio llamado chip. Una muestra que contiene ADN o ARN se pone en contacto con el chip. El apareamiento de las bases complementarias entre la muestra y las secuencias de genes en el chip produce una cantidad de luz que se puede medir. Las áreas del chip que producen luz identifican los genes que se expresan en esa muestra.

Background

Gracias a los avances tecnológicos actuales y a la creciente necesidad de concientización de las enfermedades metabólicas hereditarias, se ha logrado definir al menos 300 tipos diferentes de estas patologías, ya que el tratamiento efectivo para estas dependerá de qué tan temprano se realice el diagnóstico. El objetivo de este estudio, fue definir una expresión génica característica de un defecto en las vías metabólicas lisosomales, mitocondriales, peroxisomales, carbohidratos, aminoácidos, purinas, pirimidinas, molibdeno y la oxidación de ácidos grasos. En el estudio no se lograron encontrar transcriptomas característicos, sin embargo, se encontró que en el 16% de los casos, el gen defectuoso puede ser identificado a partir de los datos de expresión génica independientemente del trastorno metabólico subyacente.

Métodos

Muestras de pacientes y cultivo de tejidos

Las muestras que se tomaron corresponden a líneas celulares de fibroblastos obtenidos de piel humana de 68 pacientes con sospecha o confirmación de un trastorno metabólico. Las células se cultivaron con:

·         F10 de Ham

·         Suero bovino fetal al 10%

·         L-Glutamina (200 Mm)

·         Penicilina al 2%

·         Estreptomicina (5,0μg/ml)

Todo esto a una temperatura de 37°C.

Extracción de ARN y microarrays

El ARN total de los matraces triplicados se extrajo utilizando el kit™ RNeasyMini (QIAGEN, Crawley, Reino Unido).

 La tecnología RNeasy simplifica el aislamiento total de ARN (consulte la tabla "Cantidad de material de partida para los procedimientos RNeasy"). Las muestras se lisan primero y luego se homogeneizan. El etanol se agrega al lisado para proporcionar condiciones ideales de unión. El lisado se carga en la membrana de sílice RNeasy y el ARN se une a la membrana de sílice, y todos los contaminantes se eliminan de manera eficiente. Para ciertas aplicaciones de ARN que son sensibles a cantidades muy pequeñas de ADN, las cantidades residuales de ADN restantes se pueden eliminar utilizando un conveniente tratamiento con DNasa en columna. El ARN puro y concentrado se eluye en agua. Una variedad de protocolos de aplicación especiales también está disponible.

l ARN agrupado se concentró utilizando el kit de limpieza RNeasyMinElute™Cleanup (QIAGEN) y se cuantificó mediante análisis espectrofotométrico que mide la absorbancia a 260 y 280 nm.

Funciones

• Limpieza eficiente de reacciones enzimáticas
• Concentración de pequeñas cantidades de ARN a sólo 10 μl
• Limpieza de ARN purificado por diferentes métodos
• ARN de alta calidad en menos de 15 minutos

Procedimiento

El tampón de lisis que contiene guanidina-isotiocianato y el etanol se agregan a la muestra para crear condiciones que promuevan la unión selectiva del ARN a la membrana RNeasy MinElute. A continuación, la muestra se aplica a la columna de espín RNeasy MinElute. El ARN se une a la membrana de sílice, los contaminantes se eliminan de manera eficiente y el ARN de alta calidad se eluye en el agua.

El ADNc de doble cadena se sintetizó a partir de ARN de 5 μg utilizando el kit de síntesis de ADNC de un ciclo de Affymetrix siguiendo las instrucciones del fabricante (Affymetrix, High Wycombe, Reino Unido).

La síntesis de ARNc marcado con biotina se realizó utilizando el kit de etiquetado Affymetrix GeneChip IVT, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se monitorizan de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica (probe, en inglés), y la molécula diana (target), y se indican generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual indica el nivel de expresión del gen.

El ARNc marcado se purificó (módulo de limpieza de muestras) y se fragmentó y se hibridó 15 μg a las matrices Affymetrix GeneChipHuman Genome U133 Plus 2.0 durante la noche.

Análisis de datos de microarray

El chip consiste en una pequeña placa de vidrio cubierta en plástico. Algunas empresas fabrican micromatrices utilizando métodos similares a los que se usan para hacer los microchips de computadoras. En la superficie, cada chip contiene miles de secuencias cortas de ADN sintético de una sola hebra, que en conjunto forman el gen normal en cuestión, y las variantes (mutaciones) de ese gen que han sido encontradas en la población humana.

A fin de determinar si un individuo posee una mutación para una enfermedad específica, lo primero que hace un científico es obtener una muestra de ADN de la sangre del paciente, así como una muestra de control, es decir, una que no contiene una mutación en el gen de interés.

Luego, el investigador desnaturaliza el ADN en las muestras, un proceso que separa las dos hebras complementarias del ADN en moléculas de una sola hebra. El siguiente paso es cortar las largas hebras del ADN en fragmentos más pequeños y más fáciles de manejar, y luego marcar cada fragmento con un tinte fluorescente (hay otras maneras de hacer esto, pero éste es un método común). El ADN del individuo se marca con un tinte verde y el ADN de control, o normal, se marca con un tinte rojo. Ambos conjuntos de ADN marcado se insertan entonces en el chip y se dejan hibridar, o unirse, al ADN sintético en el chip.

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