LABORATORIO N°3. EXTRACCION DE ADN GENOMICO A PARTIR DE LINFOCITOS HUMANOS POR PRECIPITACION DE SALES (SALTING OUT)

LABORATORIO N°3. EXTRACCION DE ADN GENOMICO A PARTIR DE LINFOCITOS HUMANOS POR PRECIPITACION DE SALES (SALTING OUT)

Jonathan Jaimes 1610018, Dayana Parra 1610929, Margarita Rosas 1610344

Universidad Francisco de Paula Santander

Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente

Ingeniería Biotecnológica

Marzo, 2016

RESUMEN

Este laboratorio se centró principalmente en la extracción de ADN genómico a partir de muestras de sangre tomadas por algunos compañeros en donde se tuvo en cuenta la técnica de precipitación con sales más conocida como “Salthing out” en donde se debió seguir un procedimiento ya estandarizado en el cual hacían parte ciertos reactivos, equipos e instrumentos de laboratorio para poder llevar a cabo esta práctica obteniendo resultados positivos y que concuerden con lo que realmente se esperaba, además de ello profundizar en el manejo de cada uno de los instrumentos para no cometer errores que sean irremediables y se vean reflejados en los datos logrados.

Palabras clave: extracción, ADN, Salthing out, reactivos e instrumentos.

INTRODUCCIÓN

La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa de todo análisis genético. Obtener DNA relativamente puro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que será destinado, en el marco de investigaciones de tipo forense, poblacionales, predisposición a enfermedades y otros. Esta tarea demanda una “puesta a punto” de las técnicas de extracción utilizadas, con el objeto de determinar las condiciones ideales en las que se obtendrá un máximo rendimiento. En general; los métodos de extracción de DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto), concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión. Para muestras de sangre en particular, distintos protocolos han sido descriptos y publicados, pudiendo diferenciarse básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del extracto. Así podemos encontrar métodos que aprovechan las propiedades desnaturalizantes que tienen ciertos solventes orgánicos como cloroformo, fenol, etc., y a aquellos fundamentados en el conocido cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio. Así, en presencia de bajas concentraciones de sales, se verifica un ligero aumento en la solubilidad de las proteínas (salting-in) por aumento de la fuerza iónica del medio respecto de soluciones acuosas. Por el otro lado, en presencia de altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas disminuye y terminan por precipitar (salting-out). Este es el fundamento fisicoquímico de la precipitación de proteínas por salado. (Riera, Rojas, & Zapata)

Método Salting-Out. El Salting-Out es una Técnica orgánica, que utiliza reactivos bajos en toxicidad y que permite visualizar perfectamente la malla de ADN, aunque requiere una mayor cantidad de muestra.

Procedimiento: Lisis celular (División de glóbulos rojos y blancos), Precipitación, Resuspensión, Extracción del ADN.

El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información genética de generación en generación.

Éste nucleótido, está presente en todas las células de nuestro organismo, por lo que obtener una muestra es muy sencillo.

Además, las pruebas de ADN, son muy utilizadas en la actualidad, en diversos campos de la en medicina, desde para corroborar la paternidad, hasta para identificar a un criminal.

Las muestras que se utilizan para la posterior extracción del ADN humano son:

-La Sangre -Los Huesos-El Cabello

-El Semen-Los Dientes-La Saliva

-Tejidos (blog Pruebas de ADN )

La solución Tris Protege al ADN de los cambios en el pH.

Cuando las células se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer. A menudo se incluyen además, la ARNasa (destruye el ARN), las proteasas (destruye las proteínas), y el SDS (dodecilsulfato sódico, solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este caldo de contenido celular y fragmentos de ARN y proteínas puede tener un gran impacto en el pH de la solución. Debido a que el ADN es sensible al pH, es importante que la solución Tris regule el caldo y mantenga el pH en un valor fijo. (español)

Precipitación del ADN.

En la etapa final de la extracción de ADN, se extrae el propio ADN de la solución. En este punto, el ADN es soluble en el buffer. Para extraer el ADN de la solución, este se hace insoluble mediante la adición de etanol o isopropanol (alcohol isopropílico). Al hacer esto, el ADN se hace visible en la solución como una sustancia blanca filiforme. A pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo puede aislar de los componentes celulares restantes, no es "utilizable". Después de aislarlo, se elimina el alcohol, y el ADN debe ser devuelto a una solución buffer biológica, tal como la solución Tris, para ser utilizado. (español)

OBJETIVOS

• Realizar la extracción de ADN, a partir de linfocitos de sangre periférica humana.
• Utilizar la técnica de extracción de ADN por precipitación con sales “salthing out”.

MATERIALES Y METODOS

• 1 tubo con anticoagulante EDTA
• 2 tubos de polipropileno de 15 ml
• 1 micro tubo de 1.5 ml
• Guantes
• Papel para secar
• Gradillas
• Puntas
• Recipiente de descarte
• Alcohol antiséptico
• Perclorato
• Buffer de lisis I y II. SDS
• Micropipetas
• Centrifuga
• Pipetas serológicas de 5 y 10 ml

[pic 1]

Imagen #1 (reactivos)

PROCEDIMIENTO

Para llevar a cabo la extracción de ADN a partir de linfocitos fue necesario seguir el siguiente procedimiento ya establecido paso a paso para no cometer ningún tipo de error.

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RESULTADOS

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Imagen #2 (paso 1, toma de muestra)

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Imagen #3 (paso 2, agregar muestra a tubo de polipropileno)

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Imagen #4 (paso 2, buffer de lisis I)

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Imagen #5 (paso 2,  centrifugación 5 min)

[pic 7]

Imagen #6 (paso 3, quitar sobrenadante)

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