Actividad Enzimática en procesos de transformación

Laboratorio Bioquímica 2021-2[pic 1] 

Actividad Enzimática en procesos de transformación

Yulianna Chavarrío 1 y Natalia Lombana 2 

        1 Facultad de ingeniería, Universidad de la Sabana; mariachba@unisabana.edu.co 

        2 Facultad de ingeniería, Universidad de la Sabana; natalialogo@unisabana.edu.co 

        Recibido: Septiembre 15 de 2021

Abstract – The main objective of the experimental development was to measure the reaction rate of acid phosphatase extracted from wheat germ under different conditions, as well as the estimation of the kinetic parameters Km and Vmax from the experimental data with and without inhibition, identifying the experimental factors that are critical for the estimation of the kinetic parameters of the enzyme. The practice consisted of different stages divided into the extraction of acid phosphatase by means of a simple decantation process of a wheat germ solution, then a calibration curve of inorganic phosphate was made, followed by a procedure to determine the amount of phosphate produced by the action of acid phosphatase. Finally, five trials were carried out in which different parameters and conditions were varied to measure the effect of these on the reaction rate.

Key Words: Enzyme, substrate, rate of reaction, concentration, temperature, pH.

1. Introducción

En el mundo de la bioquímica ocurren una gran variedad de reacciones a nivel biológico, en donde intervienen un sinfín de componentes que permiten obtener distintos productos o rutas metabólicas. Dentro de estas reacciones y rama de la bioquímica aparece el concepto denominado como cinética enzimática, el cual corresponde a el estudio de la velocidad de las reacciones que están catalizadas por enzimas; Estas últimas son moléculas que como se menciona, actúan acelerando reacciones netamente biológicas y por lo general son de naturaleza proteica. (González, s,f.).

Debido a que las enzimas son componentes de carácter proteico, pueden desnaturalizarse tal como las proteínas y perder sus capacidades, es por esto que existen varios factores que pueden alterar su desempeño dentro de una reacción, dentro de estos factores se encuentra la temperatura, la concentración del sustrato (reactivo involucrado en la reacción), el pH o la presencia de inhibidores, los cuales son componentes que buscan disminuir la velocidad de una reacción química y se pueden tener condiciones óptimas pero estas dependen de el tipo de enzima estudiada. (Barman, 1985).

Profundizando un poco más en el campo de la cinética enzimática, se tienen diferentes ecuaciones que ayudan a describir el comportamiento de las reacciones biológicas que ocurren constantemente, dentro las cuales la más importantes es la ecuación de Michaelis-Menten que describe la velocidad de muchas reacciones enzimáticas, atribuida a dos bioquímicos muy importantes.

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Figura 1. Ecuación de Michaelis-Menten

Esta ecuación describe el cambio de la velocidad de una reacción catalizada por una encima y depende en gran cantidad de la concentración de sustrato presente y producto de esta ecuación se determinó la constante de Michaelis-Menten (Km) la cual describe la afinidad de una enzima con el sustrato, lo cual en otras palabras se puede establecer como la constante de disociación aparente entre la enzima y el sustrato. (López & García, 2015). En esta ecuación (1) se demuestra que un aumento en la concentración del sustrato repercute directamente en la velocidad de reacción aumentándola hasta un punto en el que la enzima se satura y se alcanza lo conocido como velocidad máxima de la reacción (Vmax). En adición a lo anterior, la cinética descrita por Michaelis-Menten se puede complementar con la linealización de Lineweaver-Burk, la cual funciona para calcular los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten y se basa en el recíproco o la inversa de esta cinética, es decir de la velocidad y la concentración de sustrato. (Lira & Jasso, 2013).

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Figura 2. Ecuación de Lineweaver-Burk

Con esta ecuación se puede establecer los valores de Km y Vmáx, obteniendo una recta donde el intercepto con el eje “y” es la inversa de la Vmáx y la pendiente de esta recta es Km/Vmax, con la ecuación de esta gráfica se pueden despejar estos valores para hallarlos.

Dentro de esta práctica de laboratorio que tiene como objetivo estudiar la cinética enzimática se trabajó la enzima fosfatasa ácida extraída del germen de trigo. Estas enzimas son un grupo amplio en la naturaleza con una especificidad amplia. Todas tienen una característica en común y es que actúan sobre monoésteres de ácido ortofosfórico (Jiménez, 1997) y la reacción que catalizan es la siguiente:

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La técnica a utilizar para la cuantificación de fosfato liberado es el método de Fiske-Subbarow que es un método colorimétrico basado en la reacción de fosfato con ácido molíbdico. Por último, se estudiará el efecto de diferentes factores sobre la velocidad de reacción, como lo es la concentración de sustrato, de la enzima, el pH, la temperatura, y la presencia de in inhibidor, para entonces calcular los valores óptimos de estas condiciones para la enzima fosfatasa ácida. Para estos procedimientos se utilizó como materia prima principal el germen de trigo, de donde se extrajo la enzima. Utilizando la ecuación del porcentaje de error (3) para determinar que tan distante fueron los datos obtenidos experimentalmente de lo esperado teóricamente

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1. Metodología

El desarrollo de esta practica comenzó por la extracción de la fosfatasa acida presente en el germen de trigo, para esto se  pesaron  10 gramos de germen de trigo junto a 50 ml de agua fría, esta mezcla fue agitada hasta que obtener una suspensión uniforme, que fue dejada en reposo por 30 min, y posteriormente fue decantada por 15 min, finalmente se filtro el sobrenadante a través de algodón y los residuos fueron descartados. Esta solución  es el extracto crudo de fosfatasa ácida, este estrato tuvo que ser conservado en hielo.

El siguiente paso de la practica consistió en la preparación de unas curva de calibración de fosfato inorgánico, para esto primeramente se realizaron una serie de soluciones compuestas por las cantidades de reactivos indicados en la tabla 1.

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Tabla Nº1: Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la curva de calibración

Cada tubo fue agitado y dejado en reposos durante aproximadamente 3 minutos. Posteriormente se le adicionaron 0.5 ml de la solución de ácido ascórbico a cada tubo, nuevamente fueron agitados y dejados en reposos por 10 minutos hasta que desarrollaron una coloración. Finalmente se realizo la medida de la absorbancia de cada tuvo a 660nm. Posteriormente a la recopilación de datos para la curva de calibración, se procedió a realizar el procedimiento A1 para determinación de cantidad de fosfato producido por acción de fosfatasa acida, este consistió en la realización de la mezcla de reacción indicada en la tabla Nº2 y en el orden allí propuesto.

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Tabla Nº2: Volúmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reacción para determinación de fosfato

Estos tubos fueron agitados y dejados en reposos por 3 minutos, pasado este tiempo se le agregaron 0.5 ml de ácido ascórbico, se agitaron y dejaron  en reposo por 10 minutos para  leer absorbancia a 660nm. Dichos valores de absorbancia, se emplearon en la curva de calibración preparada con el fin de determinar la cantidad de fosfato.

La siguiente etapa de la practica consistió un ensayo para a determinación del tiempo optimo de incubación conveniente para obtener una cantidad de fosfato  que, por colorimetría se obtuvieran valores de %T entre 20 y 80, absorbancias entre 0.1 y 1, y adicionalmente correspondan a la parte recta de la curva de progreso de la reacción. Para este ensayo se inicio preparando la mezcla de reacción indicada en la tabla Nº3.

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Tabla Nº3: Volúmenes de reactivos para prueba de tiempo óptimo

Estas soluciones fueron agitadas e incubadas a temperatura ambiente, el blanco de buffer y el blanco de sustrato se dejaron reaccionar 30 minutos. Y pasado este tiempo se extrajeron alícuotas de 1 ml que fueron puestas sobre ácido tricloroacético al 10%. Adicionalmente, durante los 30 minutos en que se mantuvieron  en incubación BB y BS, se tomaron muestras de 1 ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos. Dichas alícuotas fueron recibidas en tubos que contenían 1 ml de ácido tricloroacético al 10%, los tubos fueron agitados y sometidos a  centrifugación  a 4000 rpm durante 3 minutos. Finalmente se determino la cantidad de fosfato producido en el sobrenadante con el procedimiento A1.

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