Aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger
Enviado por Karina Fonseca • 2 de Noviembre de 2015 • Prácticas o problemas • 747 Palabras (3 Páginas) • 945 Visitas
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Objetivos
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger
Introducción
El método de 1-fluoro-2,4,dinitrobenceno (DNFB) para la determinación en péptidos y proteínas de los aminoácidos con el grupo alfa amino libre fue introducido por F. Sanger La determinación cosnsite en la dinitrofnilación del aminoácido N-terminal de la proteína, la eliminación del DNFB que no reaccionó, hidrólisis de la DNP-proteína y de la identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel.
¿Qué hicimos? | ¿Para qué? |
Hemolobina+Bicarbonato de Sodio+DNFB | Para que reactivo de DNFB reaccione con la proteína, se tiene que llevar a cabo en condiciones alcalinas |
Agreamos HCl al 3 N | Para detener la reacción |
Agregamos éter saturado con solución acusosa de FeSO4 | Para obtener la fase acuosa de la solución |
Colocar en la proteína dinitrofenilada en baño maria y agitar | Para eliminar cualquier residuo de la fase etérea que pudo haber quedado |
Centrifugamos a 3000rpm a 15 minutos | Para eliminar el sobrenadante |
Añadimos HCl al 6N | Para que la proteína se hidrolizara en condiciones ácidas. |
Después se calentó en autoclave a 3 horas y 15 libras | Para que la hidrolisis se llevara a cabo se necesitaban de éstas condiciones de temperatura y presión |
Agregamos éter saturado, en 3 porciones | Para obtener el hidrolizado |
En papel Whatman, se realizó una cormatografía en papel | Para la identificación del residuo N-terminal de la hemoglobina |
Utilizando ácido cítrico, citrato de sodio | Como solvente |
Se colocó dicho cromatograma, en una cámara previamente saturada con el solvente |
Se realzó el mismo procedimiento de cromatografía para DNP-phe, DNP-Asp. Dnp-Val | Para comparar los resultados obtenidos de Rf, para cada aminoácido |
Después de 5 horas, sacamos los cromatogramas de la cámara, y se marcó el frente del solvente | Para obtener los datos necesarios para realizar los cálculos de rRf |
Por dicha cromatografía se identificó el residuo N-terminal de la proteína hemoglobina | Que en este caso el más cercano es el de la valina , debido a que el Rf DNP-val fue de 0.88 y el de nuestro problema se obtuvo de Rf problema= 0.84 |
Resultados:
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Fig 1. Representación del cromatograma realizado en la práctica
- Distancia recorrida de la fase móvil: 32 cm (Fd)
- Distancia recorrida del problema: 26.9
Fórmula
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Compuesto | Fs | Rf |
DNP- Phe | 24 cm | [pic 15] |
DNP- Val | 28.3 cm | [pic 16] |
DNP-Ala | 24.5 cm | [pic 17] |
DNF | 19 cm | [pic 18] |
Problema | 26.9 cm | [pic 19] |
Análisis de resultados:
Mediante el método de Sanger se determinó experimentalmente el grupo amino libre de la molécula hemoglobina mediante una cromatografía en papel para su identificación con aminoácidos dinitrofenilados como referencia junto con nuestro producto hidrolizado, de acuerdo con la bibliografía la hemoglobina está conformada por cuatro polipéptidos: dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Cada cadena alfa está constituida por 141 aminoácidos y la valina es el aminoácido con el grupo alfa amino libre, es decir el amino terminal y la cadena beta contiene 146 aminoácidos también con la valina con el el grupo alfa amino libre………………..(3)
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