Identifica mediante pruebas cualitativas la presencia de aminoácidos.

Objetivos

• Identifica mediante pruebas cualitativas la presencia de aminoácidos.

• Aislar proteínas de interés biológico e identificarlas mediante pruebas cualitativas.

• Observar el fenómeno de la desnaturalización sobre una proteína modelo.

• Identificar el punto isoeléctrico de una proteína.

• Conocer y comparar dos métodos de cuantificación de proteínas: Bradford y Biuret.

• Comprender el principio de la cromatografía y electroforesis de proteínas.

Competencias

• Capacidad de absorción, análisis y síntesis para integrar la estructura de los aminoácidos durante las pruebas cualitativas.

• Conocimiento y aplicación de los factores caotrópicos para aislar ciertas proteínas de interés biológico.

• Capacidad para la investigación para comparar el punto isoeléctrico de una proteína experimental y teórico.

• Habilidad para el trabajo en forma colaborativa, para comprender los métodos de cuantificación de proteínas comúnmente utilizados y demostrar la importancia de su aplicación.

• Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica, para identificar por métodos experimentales el peso molecular de proteínas, así como identificar la presencia de algunos aminoácidos en muestras problema a través del uso de cromatografía.

• Analiza los resultados obtenidos de acuerdo a observaciones.

• Capacidad de abstracción, análisis y síntesis.

• Capacidad de pensamiento crítico y reflexivo.

• Capacidad de trabajo en equipo.

Introducción

Las proteínas están formadas por la unión de distintos eslabones, llamados aminoácidos. Una proteína tiene más de 100 aminoácidos y son fundamentales para el funcionamiento del organismo, estas son moléculas de mayor complejidad estructural y refinamiento funcional. Se conforman por una estructura primaria en el cual se determina por una secuencia lineal de aminoácidos. Su estructura secundaria adopta espacialmente una parte del poli péptido, ocurre cuando los hidrógenos de la secuencia interactúan mediante puentes de hidrógeno. Cuando se realiza el plegamiento total de la proteína estamos hablando de su estructura terciaria. En la estructura cuaternaria se ve presentada cuando una proteína está constituida por más de una subunidad y lo que hacen es que estas se pliegan para que la proteína tenga funcionalidad.

Llamamos desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

En esta práctica vamos a realizar reacciones cualitativas de coloración, que nos permitirán detectar, la presencia de grupos químicos en aminoácidos y proteínas. La reacción de la ninhidrina es general para cualquier aminoácido y es debido a la presencia del grupo amino (NH2), de manera de que todos los alfa aminoácidos y por supuesto las proteínas dan positiva a esta reacción.

La determinación de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Entre los métodos calorimétricos destacan el método de Biuret y el método de Bradford, los cuales se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para observar luz en el UV, también para la formación de derivados químicos, así como para la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas en la determinación de la identidad de sustancias, en la separación de componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos.

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte.

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

Actividades Preliminares

Se requieren las siguientes soluciones para trabajar durante la práctica.

Ninhidrina 1% solubilizada en etanol

Reactivo de Biuret. Disolver 3,8 g de CuSO4 5H2O Y 6.7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de Kl como estabilizante. Guardar en frasco de plástico, cubierto con papel aluminio.

Reactivo de Bradford. Mezclar 10 mg de Comassie Blue G-250 con 10 ml de fosfórico al 88% y 4.7 ml de etanol absoluto. Aforar con agua destilada hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en un recipiente ambar o de vidrio forrado con papel aluminio.

Los aminoácidos se disuelven y se aforan a 25 ml en un matraz aforado con disolución 0.5 M de HCL en etanol.

Actividad 1. Identificación cualitativa de aminoácidos.

Reacción de la Ninhidrina

Se colocó 2ml de la solución de aminoácidos al 2% en un tubo de ensayo y se agregó 5 gotas de la solución de ninhidrina al 1%. Posterior a esto se calentó en baño maría por 5 minutos.

En esta parte se identificaron los aminoácidos de forma cualitativa en base a la reacción de la Ninhidrina en donde resulto ser positiva para aminoácidos y proteínas que tengan un grupo -NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azul-violeta.

Reactivo de Biuret

En esta parte colocamos 2 ml de solución de aminoácidos al 2% en un tubo de ensayo. Después agregamos 1ml de ácido nítrico concentrado, mezclamos bien y posterior a esto lo calentamos a baño maría y observamos. Luego adicionamos 2 ml de NaOH 40% lentamente sin agitar y de nuevo observamos.

En base al procedimiento podemos decir que el compuesto orgánico Biuret también da positiva a esta reacción, la cual se basa en las formaciones en medio alcalino, de un complejo de coordinación de color violeta entre el ion cúprico (Cu+2) y 4 átomos de nitrógeno, provenientes de las cadenas peptídicas.

Actividad 1

Tabla 5 Reacciones de identificación de aminoácidos.

Sustancia Ninhidrina Biuret

Agua Si reacciona

5% Ovoalbúmina No reacciona

Tirosina No reacciona

Triptófano No reacciona

Arginina No reacciona

Metionina/Serina No reacciona

Muestra problema

Problema No reacciona

Resultados actividad 2

Aislamiento de proteínas de interés biológico e identificación cualitativa

Se recuperaron 17ml de la clara del huevo pero al final se obtuvieron 34ml ya que se le añadió un volumen igual de la solución de sulfato de amonio saturado se

Se separó el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina por centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos

Caseína

Se calentaron 100 mL de leche semidescremada, a la que se le agregó, de forma lenta, 10 mL de ácido acético al 10%, para que el pH cambiara a 4.6.

Se dejó reposar por 10 minutos

Y después de los 10 minutos se pudo observar la desnaturalización de la caseína.

Se mezcló la suspensión y la distribuimos en tubos de centrífuga.

Esto se observó después de centrifugar por 10 minutos.

Se lavó varias veces con diferentes soluciones.

Al finalizar los lavados, quedó una pequeña porción de caseína sólida, la cual pesamos 2 mg y le agregamos 2 mL hasta que solubilizó. Lo conservamos en refrigeración.

Actividad 3

b) Determinación del punto isoeléctrico de la caseína

1. Lo primero que se hizo fue colocar 250 mg de caseína en un vaso de precipitado de 250 ml. Después agregamos 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH; se agito hasta que lográramos una solución total de la caseína.

Una vez que la caseína se disolvió lo vertimos en un matraz aforado de 50 ml de ácido acético 1N, después aforamos con agua destilada hasta 50 ml. Mezclamos muy bien y si la solución no se veía clara y limpia teníamos que filtrar con papel, eso fue lo que hicimos al final.

2. Preparar una serie de 10 tubos.

Tabla 1.1. Soluciones con pH diferentes para encontrar el pH de la caseína.

Tubo Acetato de potasio 0.1N Ácido acético 0.1N Ácido acético 0.01N pH

1 0.5 9.5 --- 3.01

2 1 9 --- 3.42

3 1.5 8.5 --- 3.63

4 2 8 --- 3.83

5 3 7 --- 4.09

6 4 6 --- 4.33

7 6 4 --- 8.76

8 8 2 --- 5.27

9 6 --- 4 5.4

10 8 --- 2 6.02

3. Medimos el pH de cada tubo y lo fuimos registrando en la tabla., se anotaron los valores reales del pH en la tabla correspondiente, estos debían ser semejantes a los expresados y en todos los casos crecientes.

A cada tubo se le agrego 1ml

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