Bioquímica y Biología molecular

PRACTICAS DE BIOQUIMICA

Asignatura: “BIOQUÍMICA y BIOLOGÍA MOLECULAR”

1º DE Ciencias Ambientales

Curso 05/06

Universidad de Huelva

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

Departamento de Química y Ciencia de los Materiales

Área de Bioquímica y Biología Molecular

INDICE

INTRODUCCIÓN

1. CULTIVO EN MEDIO SOLIDO DEL ALGA VERDE UNICELULAR C. reinhardtii.

1.1 Preparación del medio de cultivo. 1 por mesa cada (8 parejas).

1.2 Preparación del medio de cultivo sólido. 1 por mesa cada (8 parejas)

1.3 Inoculación e incubación del cultivo

1.4 Observación de las colonias

2. DETERMINACIÓN DE LOS COMPONENTES CELULARES EN HOJAS DE ESPINACA

2.1. Determinación del contenido en agua de la hoja de espinaca

2.2. Determinación del contenido en clorofila

-2.2.A. Extracción de pigmentos en hoja de espinaca

-2.2.B. Determinación de clorofila

-2.2.C. Obtención del espectro de absorción de la clorofila

2.3. Determinación del contenido en proteínas y carbohidratos

-2.3.A. Preparación de un extracto crudo de hojas de espinaca

-2.3.B. Determinación del contenido en proteínas

-2.3.C. Determinación del contenido en carbohidratos

3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSTATASA ALCALINA DE INTESTINO DE TERNERA

3.1. Variación de la actividad enzimática con la concentración

3.2. Cálculo de la Km y la Vmax

INTRODUCCIÓN

El objetivo de estas prácticas es el de familiarizar al alumno de primer curso en el conocimiento y manejo de algunas técnicas y aparatos de uso común en un laboratorio de Bioquímica. Se ha diseñado para ello, utilizando organismos fotosintéticos como material biológico de partida, un esquema de prácticas que permitirá al alumno realizar determinaciones cuantitativas de moléculas biológicas mediante técnicas colorimétricas, aprendiendo a usar un espectrofotómetro UV/Vis. Conocerá, de esta forma, cómo realizar una recta de calibrado e interpolar los resultados obtenidos. Aprenderá asimismo a preparar un ensayo de actividad enzimática, y a evaluarla mediante determinaciones espectrofotométricas. Tendrá también que preparar un cultivo de células de Chlamydomonas reinardtii en medio sólido

CÓMO HACER REGRESIONES LINEALES

Durante el desarrollo de las prácticas obtendremos series de datos experimentales. Para hacer cálculos habrá que asignar datos al eje de las “x” y datos al eje de las “y” y representamos gráficamente unos frente a otros obteniendo puntos entre los que existe una relación lineal y que pueden unirse mediante una línea recta.

El problema general consiste en encontrar la recta que mejor se ajusta a los puntos obtenidos. Este ajuste puede dejarse a la iniciativa de cada experimentador (método libre de ajuste de curvas) o definir la curva de ajuste mejor como aquella que tiene la propiedad de que la suma de los cuadrados de las desviaciones de la curva real respecto a los valores experimentales es mínima. Una recta con esa propiedad se llama recta de mínimos cuadrados siendo la ecuación de la recta:

La ecuación de la recta de mínimos cuadrados y su representación gráfica también puede obtenerse mediante un programa informático como Excel, Origin, etc..La mayoría de las calculadoras científicas también nos puede proporcionar los datos para obtener la ecuación de la recta.

1 CULTIVO EN MEDIO SOLIDO DEL ALGA VERDE UNICELULAR C. reinhardtii

Esta práctica tiene por objeto realizar un cultivo en medio sólido del alga eucariótica unicelular Chlamydomonas reinhardtii, estirpe silvestre 21 gr, perteneciente al género Chlorophyceae. Esta microalga tiene un núcleo central, un gran cloroplasto en forma de copa y un par de flagelos que le proporcionan movilidad.

Las células se cultivan autotróficamente en una cámara climatizada (25-30ºC) y con iluminación continua de luz fluorescente blanca de 50 w/m2. El medio de cultivo utilizado depende del tipo de alga verde utilizada: para Chlamydomonas reinhardtii. Se utiliza medio SUEOKA suplementado con agar para conseguir su solidificación.

1.1. Preparación del medio de cultivo. 1 por mesa cada (8 parejas).

- Añadir en un matraz erlenmeyer de 500 ml las siguientes cantidades:

KPO4H2....................................................................................... 0.36 g

K2PO4H................................................................................……....0.72 g

Disolución de MgSO4•7H2O (61 mg/ml)................................0.5ml

Disolución de CaCl2•2 H2O (20 mg/ml)................................0.5 ml

Trazas Hutner.............................................................................2.5 ml

NH4Cl...............................................................................................0.25g

- Completar hasta aproximadamente 0.5 L con agua destilada

- Agitar hasta disolución

1.2

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